使用抗雄激素藥物HF或ASC-J9_可以提高BCG的治療效果抑制膀胱癌的進(jìn)展.pdf

1、目的：對于高危非肌層浸潤性膀胱（NMIBC）癌患者，卡介苗（BCG）膀胱灌注免疫治療一直是標(biāo)準(zhǔn)的一線治療方案，但是BCG免疫治療存在很多局限。最近有研究發(fā)現(xiàn)雄激素受體(AR)以及雄激素信號通路在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。本研究試圖聯(lián)合應(yīng)用BCG和抗雄激素藥物，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)來探討B(tài)CG和抗雄激素藥物聯(lián)用是否能夠更好的抑制膀胱癌的進(jìn)展及其作用機(jī)制。
　　方法：⑴Western-Blot檢測T24細(xì)胞及253J細(xì)胞

2、中AR的表達(dá)水平；⑵設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組：單獨(dú)應(yīng)用 BCG組，BCG聯(lián)合應(yīng)用抗雄激素藥物羥基氟他胺（HF）組，BCG聯(lián)合應(yīng)用雄激素降解劑二甲基姜黃素（ASC-J9?）組，分別用上述各組處理T24及253J細(xì)胞，用普通PCR法檢測膀胱癌細(xì)胞BCG的表達(dá)情況；用Q-PCR法檢測膀胱癌細(xì)胞整合蛋白α5、β1的mRNA的表達(dá)情況；⑶通過細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證經(jīng)過不同處理的（單獨(dú)應(yīng)用BCG或與抗雄激素藥物聯(lián)用）膀胱癌細(xì)胞募集單核細(xì)胞 THP-1細(xì)胞的能力：將數(shù)

3、量大致相同的膀胱癌細(xì)胞鋪到Transwell的下室中，經(jīng)過BCG或者BCG聯(lián)合抗雄激素藥物處理后，上室中加入數(shù)量大致相同的 THP-1細(xì)胞，培養(yǎng)2小時(shí)后收集下室培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)其中的THP-1細(xì)胞數(shù)量作比較；將T24細(xì)胞及253J細(xì)胞做不同的處理后，檢測了膀胱癌細(xì)胞分泌的有關(guān)免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子，如 IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，CCL-2等的表達(dá)情況，對比產(chǎn)生的變化；⑷對THP-1細(xì)胞使用不同的實(shí)驗(yàn)條件處理（單獨(dú)應(yīng)用BCG或與抗

4、雄激素藥物聯(lián)用），通過Elisa檢測不同條件下THP-1細(xì)胞TNF-α的分泌情況；提取經(jīng)過不同處理的THP-1的細(xì)胞培養(yǎng)基處理膀胱癌細(xì)胞系，使用MTT檢測膀胱癌細(xì)胞的生存能力差異。⑸根據(jù)血尿程度將小鼠隨機(jī)分為四組，分別是BCG組、ASC-J9?組、BCG+ASC-J9、對照組，每組十只。⑹通過不同實(shí)驗(yàn)條件處理小鼠，處理完成后每組分別處死五只小鼠，取膀胱制成蠟塊，行HE染色觀察小鼠膀胱上皮細(xì)胞形態(tài)，行BrdU染色觀察小鼠膀胱上皮細(xì)胞增殖情

5、況，行F4/80免疫組化染色觀察巨噬細(xì)胞局部浸潤情況；⑺繼續(xù)飼養(yǎng)每組剩余五只小鼠，觀察其生存率的差異。
　　結(jié)果：①在T24細(xì)胞及253J細(xì)胞中，都有AR表達(dá)；使用5μM ASC-J9處理細(xì)胞后，AR的表達(dá)水平降低；②分別用不同條件處理T24及253J細(xì)胞后，用普通PCR法檢測膀胱癌細(xì)胞BCG的表達(dá)可見當(dāng)BCG與HF或ASC-J9聯(lián)用后，膀胱癌細(xì)胞中BCG的表達(dá)有所升高，且升高將近2倍；使用Q-PCR檢測膀胱癌細(xì)胞中整合蛋白α5、

6、β1的mRNA的表達(dá)可見BCG與HF或ASC-J9聯(lián)用后，整合蛋白α5、β1的 mRNA的表達(dá)升高；③通過細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)可見，當(dāng) BCG與HF或ASC-J9?聯(lián)用處理膀胱癌細(xì)胞后，可以引起更多的THP-1細(xì)胞遷移向腫瘤細(xì)胞；使用Q-PCR檢測使用不同條件處理膀胱癌細(xì)胞后，相關(guān)免疫分子mRNA的表達(dá)情況，可見IL-6的表達(dá)在BCG與HF或ASC-J9聯(lián)用后升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；④通過Elisa實(shí)驗(yàn)可見，用BCG與HF或ASC-J9聯(lián)用處理

7、THP-1細(xì)胞后，可使THP-1細(xì)胞分泌更多的TNF-α；提取經(jīng)過不同處理的THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)基，用來培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞，通過MTT可見BCG與HF或ASC-J9?聯(lián)用處理THP-1的培養(yǎng)基培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞，可使膀胱癌細(xì)胞的生存能力明顯降低。⑤通過應(yīng)用HE染色我們發(fā)現(xiàn)，對照組和 ASC-J9?組小鼠膀胱出現(xiàn)了尿路上皮乳頭狀癌和原位癌，BCG組小鼠膀胱切片可見少量的尿路上皮癌及少量的非典型增生，BCG+ASC-J9?組小鼠僅見少量的非典型增生

8、，很少發(fā)現(xiàn)膀胱癌細(xì)胞；⑥與BCG組及ASC-J9組相比，對照組表達(dá)BrdU的膀胱尿路上皮細(xì)胞數(shù)目最多，而BCG+ ASC-J9?組達(dá)BrdU的膀胱尿路上皮細(xì)胞數(shù)目最少；⑦與對照組相比， BCG組及 ASC-J9 F4/80陽性細(xì)胞數(shù)相對較多，而 BCG+ASC-J9組F4/80陽性細(xì)胞數(shù)目最多；⑧小鼠生存率：對照組小鼠平均生存31.12±2.28周；ASC-J9組小鼠平均生存31.83±2.36周，與對照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；BCG組小

9、鼠平均生存35.64±2.73周，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；BCG+ASC-J9組小鼠平均生存39.67±3.56周，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：⑴與單獨(dú)應(yīng)用BCG相比，羥基氟他胺（HF）或者ASC-J9?與BCG連用提高了BCG與腫瘤細(xì)胞的接觸、內(nèi)化能力，從而更好地抑制腫瘤細(xì)胞生長；⑵羥基氟他胺（HF）或者ASC-J9治療增加了腫瘤細(xì)胞白介素6（IL-6）的釋放，從而可以募集更多的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，通過分泌更多的