職業(yè)性噪聲聽力損失敏感人群全外顯子SNP特征分析及遺傳易感標(biāo)志的研究.pdf

1、噪聲性聽力損失(Noise-induced Hearing Loss，NIHL)是長(zhǎng)期接觸有害噪聲引起的進(jìn)行性感音神經(jīng)性聽力損傷。NIHL是由環(huán)境因素和遺傳因素交互作用發(fā)生的。以往研究關(guān)注較長(zhǎng)時(shí)間噪聲暴露的遺傳易感性，但我們先期的研究發(fā)現(xiàn)，新入職的青年工人，排除其他聽力損失的原因，在職業(yè)噪聲暴露三年內(nèi)存在聽力損失的風(fēng)險(xiǎn)，為職業(yè)性噪聲暴露的敏感人群。本研究主要探討該NIHL敏感人群的遺傳易感性。首先采用全外顯子組測(cè)序法對(duì)5例短期內(nèi)接觸噪聲

2、發(fā)生NIHL的青年工人進(jìn)行外顯子測(cè)序，對(duì)比SNP（亞洲人群頻率篩選）數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選候選的易感SNP位點(diǎn);進(jìn)而對(duì)候選SNP位點(diǎn)與青年工人較短時(shí)間發(fā)生NIHL的相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)一步探討候選SNP位點(diǎn)與一般噪聲暴露人群NIHL的相關(guān)性;最后通過構(gòu)建NIHL動(dòng)物模型，檢測(cè)候選SNP的基因在噪聲暴露后mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，以確定靶基因是否在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)噪聲暴露進(jìn)行應(yīng)答，在機(jī)制上驗(yàn)證易感性關(guān)聯(lián)的可能性。
　　1.噪聲敏感人群的全外顯子組測(cè)

3、序及候選SNP篩選
　　對(duì)5例噪聲暴露三年內(nèi)就發(fā)生NIHL的新人職青年工人進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，測(cè)序過程包括DNA提取、DNA質(zhì)檢、文庫(kù)構(gòu)建、外顯子區(qū)域捕獲、高通量測(cè)序、生物信息學(xué)分析。通過比對(duì)SNP（亞洲人群頻率篩選）數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)SNP位點(diǎn)位于外顯子區(qū)域、突變?yōu)榉峭x突變、4個(gè)以上測(cè)序樣本都發(fā)生突變，而正常漢族人群中等位基因頻率突小于0.2等標(biāo)準(zhǔn)納入目的靶基因。一共篩選出27個(gè)SNP位點(diǎn)，其中5個(gè)測(cè)序樣本都突變的SNP位點(diǎn)有6個(gè)，

4、包括TTLL4 rs3731877、STK36rs1344642、BSPH1 rs60213124、HGC6.3 rs76543658、COL28A1 rs6952195、COL28A1 rs55745506。其中TTLL4基因編碼的蛋白是一種催化微管蛋白絡(luò)氨酸殘基磷酸化的蛋白，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、分化過程中具有重要的作用;STK36基因編碼的蛋白屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族;STK36基因的缺陷可能導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)纖毛功能性缺失;BSPH1基因

5、編碼粘附相關(guān)蛋白，參與機(jī)體能量代謝;基因庫(kù)中對(duì)于HGC6.3基因尚無明確定義;COL28A1基因編碼的蛋白質(zhì)屬于膠原蛋白家族，是一種生物性高分子化合物，在人體細(xì)胞中扮演結(jié)合組織的角色。
　　2.候選SNP與噪聲性聽力損失遺傳易感性的研究
　　2.1外顯子測(cè)序目的靶基因位點(diǎn)多態(tài)性與NIHL的相關(guān)性分析
　　本研究著重對(duì)TTLL4 rs3731877、STK36 rs1344642、BSPH1 rs60213124等三個(gè)S

6、NP位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。采用1∶1配對(duì)病例對(duì)照方法，首先以19對(duì)接噪工齡小于3年的發(fā)生NIHL的工人和對(duì)照為研究對(duì)象，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)和直接測(cè)序法，分析候選SNP與NIHL易感性的相關(guān)關(guān)系;進(jìn)而以177對(duì)發(fā)生NIHL的工人和對(duì)照為研究對(duì)象，對(duì)目的靶基因的多態(tài)性與NIHL易感性進(jìn)行分析，并對(duì)靶基因多態(tài)性與NIHL的相關(guān)性進(jìn)行了年齡、工齡分層分析。研究結(jié)果顯示在短期內(nèi)接觸噪聲發(fā)生NIHL的青年工人中，BSPH1rs60213124位點(diǎn)的G、A等位

7、基因頻率分布在組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=6.33，P＜0.05）;顯性模型(AA/AG VS.GG)分析結(jié)果顯示攜帶AA/AG基因型的個(gè)體患NIHL的危險(xiǎn)度是攜帶GG基因型個(gè)體的7.65倍(OR=7.65，95％CI=1.37-42.71)。未發(fā)現(xiàn)BSPH1rs60213124、TTLL4rs3731877、STK36rs1344642位點(diǎn)多態(tài)性與其他工齡和年齡組發(fā)生NIHL的相關(guān)性。研究結(jié)果提示，BSPH1 rs60213124位點(diǎn)可

8、能是短期內(nèi)接觸噪聲青年工人發(fā)生NIHL的易感基因位點(diǎn)，但結(jié)果需要加大樣本量進(jìn)一步研究。
　　2.2 GJB2、NCL、CDH23、PCDH15基因多態(tài)性與NIHL的相關(guān)性分析
　　本研究旨在探討GJB2基因rs2274083、rs2284084、rs72474224、NCL基因rs7598759、CDH23基因rs10999947、PCDH15基因rs4935502、rs108252693等位點(diǎn)的多態(tài)性與NIHL的相關(guān)性。研

9、究結(jié)果表明，GJB2基因rs2274084的基因型分布在兩組組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=8.51，P=0.014），等位基因分布在兩組間也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=8.06，P=0.005)，攜帶CC基因型的個(gè)體患NIHL的危險(xiǎn)度是攜帶TT基因型個(gè)體的2.17倍（OR=2.17，95％CI=1.04-4.53）。對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行工齡分層分析，在小于5年工齡組和大于15年工齡組，該位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率分布在病例組和對(duì)照組之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

10、，并且大于15年工齡組的攜帶CC基因型個(gè)體罹患NIHL的危險(xiǎn)度要高于小于5年工齡組攜帶CC基因型的個(gè)體。CDH23rs10999947位點(diǎn)基因型分布在病例組和對(duì)照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=8.82，P=0.01），攜帶GG基因型的個(gè)體患NIHL的危險(xiǎn)度是AA基因型個(gè)體的4.03倍(OR=4.03，95％CI=1.44-11.3)。該位點(diǎn)隱形模型分析結(jié)果顯示，攜帶GG/AG基因型的個(gè)體患NIHL的危險(xiǎn)度是AA基因型個(gè)體的4.14倍(OR

11、=4.14，95％CI=1.51-11.34)。對(duì)該SNP位點(diǎn)進(jìn)行人群年齡與工齡分層分析，結(jié)果顯示在年齡35-45歲段，該位點(diǎn)多態(tài)性與NIHL存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)（x2=6.3，P=0.04）。研究結(jié)果提示,GJB2基因rs2274084和CDH23基因rs10999947位點(diǎn)可能是NIHL的易感基因位點(diǎn)。
　　3.NIHL動(dòng)物模型的構(gòu)建及耳蝸靶基因mRNA表達(dá)的檢測(cè)
　　采用白噪聲暴露小鼠的方式構(gòu)建NIHL的動(dòng)物模型，對(duì)小鼠耳蝸

12、內(nèi)靶基因在噪聲暴露后mRNA相對(duì)表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以判斷目的靶基因是否在轉(zhuǎn)錄水平上在參與了NIHL的發(fā)生過程。ABR檢測(cè)結(jié)果顯示，噪聲暴露后兩組小鼠聽閾值組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，并且隨著電測(cè)聽頻率的升高，聽閾差值存在增大的趨勢(shì)?；啄や伷梢娫肼暯M小鼠耳蝸毛細(xì)胞出現(xiàn)缺損、倒伏嚴(yán)重。應(yīng)用熒光定量PCR對(duì)目的靶基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)GJB2基因、CDH23基因、PCDH15基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.0

13、5)。而對(duì)于其他靶基因，本研究未發(fā)現(xiàn)mRNA表達(dá)的差異。結(jié)果提示本研究構(gòu)建NIHL動(dòng)物模型成功，GJB2基因、CDH23基因、PCDH15基因可能參與了NIHL的發(fā)生過程。
　　4.總結(jié)
　　經(jīng)外顯子測(cè)序和比對(duì)SNP（亞洲人群頻率篩選）數(shù)據(jù)庫(kù)，初步獲得6個(gè)可能的青年工人短期內(nèi)噪聲暴露發(fā)生NIHL的候選SNP位點(diǎn)，經(jīng)以接噪工齡小于3年發(fā)生NIHL的工人和對(duì)照為研究對(duì)象，分析候選SNP與NIHL易感性的相關(guān)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)BSPH1r

14、s60213124位點(diǎn)可能是短期內(nèi)接觸噪聲青年工人發(fā)生NIHL的易感基因位點(diǎn)。
　　對(duì)GJB2、NCL、CDH23、PCDH15基因多態(tài)性與NIHL的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)GJB2基因rs2274084和CDH23基因rs10999947位點(diǎn)與NIHL存在著相關(guān)性，GJB2基因rs2274084位點(diǎn)的CC基因型和CDH23基因rs10999947位點(diǎn)的GG基因型可能是噪聲性聽力損失的易感基因型。
　　采用白噪聲暴露小鼠的方式成功構(gòu)建