回轉(zhuǎn)模擬失重通過激活自噬影響血管內(nèi)皮細胞功能的相關(guān)機制研究.pdf

1、研究背景：
　　失重導(dǎo)致的心血管功能失調(diào)是長期航天飛行中航天員面臨的健康問題之一，其主要表現(xiàn)為立位耐力降低和運動能力下降，嚴重者可出現(xiàn)暈厥，嚴重危害航天員的健康，而目前對抗心血管功能失調(diào)的措施極其有限，因此，深入研究其發(fā)生機理對發(fā)展有效的防護措施意義重大。
　　血管內(nèi)皮細胞作為血管的內(nèi)層襯里，通過自分泌、旁分泌、血管生成、白細胞粘附、調(diào)節(jié)血管壁通透性和調(diào)節(jié)血管平滑肌收縮等途徑在血管功能中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。
　　自噬是

2、細胞為了保持自身穩(wěn)態(tài)對于外界環(huán)境變化做出的應(yīng)激性反應(yīng)。大量研究表明，血管內(nèi)皮細胞的自噬與多種心血管功能紊亂和疾病有密切的關(guān)系。近年來，本課題組研究發(fā)現(xiàn)模擬失重后，在細胞和整體水平血管內(nèi)皮細胞自噬水平均有增強，因此我們推測自噬激活可能在失重致血管功能失調(diào)中發(fā)揮重要作用，深入探討其作用機制對于明確其作用靶點具有重要的價值。
　　目的：
　　本課題擬在前期研究基礎(chǔ)上，探討自噬與失重后血管內(nèi)皮細胞功能改變的關(guān)系，從細胞和分子水平闡明

3、失重誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞自噬的調(diào)控機制。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng) HUVECs，隨機分為回轉(zhuǎn)模擬失重24h(24hMG)、48h(48hMG)和72h(72hMG)組以及地面正常重力對照24h(24hCon)、48h(48hCon)和72h(72hCon)組， Western blot檢測自噬標志性分子LC3和p62的時程變化；免疫熒光檢測HUVECs和PMVECs在回轉(zhuǎn)48h后的LC3斑點聚集情況，透射電子顯微鏡分別檢測

4、回轉(zhuǎn)48h后HUVECs和PMVECs中的自噬體和自噬溶酶體。
　　2.將3-MA作為自噬的特異性阻斷劑，將HUVECs分為地面正常重力對照組（Con）、地面正常重力對照+3-MA組（Con+3-MA）、回轉(zhuǎn)模擬失重組（MG）、回轉(zhuǎn)模擬失重+3-MA組（MG+3-MA），回轉(zhuǎn)模擬失重48h后Western blot檢測HUVECs中LC3II與 LC3I的比值以及 p62蛋白的表達量，檢測凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2、Bax及活化的c

5、aspase3的表達，AnnexinV-FITC/PI雙染色后經(jīng)流式細胞儀測定凋亡率，Transwell侵襲小室實驗和劃痕實驗檢測細胞的遷移能力。
　　3.在HUVECs回轉(zhuǎn)模擬失重48h后，Western blot檢測LC3、p62、p53、磷酸化AMPK和反映mTOR活性的磷酸化p70S6K的蛋白表達變化；在地面正常重力下敲低HUVECs中p53的表達以及回轉(zhuǎn)模擬失重下過表達p53，而后檢測HUVECs中自噬相關(guān)分子LC3、p

6、62和磷酸化p70S6K的蛋白表達變化，免疫熒光顯微鏡測定各組細胞中LC3的斑點聚集情況。
　　4.回轉(zhuǎn)模擬失重48h后，Western blot檢測HUVECs胞質(zhì)胞核中p53的表達變化，實時熒光定量PCR檢測HUVECs中p53 mRNA的變化；在沉默HDM2及應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132兩種條件下分別檢測回轉(zhuǎn)模擬失重48h后HUVECs中LC3、p53、p62和磷酸化p70S6K的表達，免疫熒光檢測HUVECs中LC3斑點聚

7、集情況；免疫共沉淀檢測HUVECs回轉(zhuǎn)模擬失重48h后HDM2與p53之間的結(jié)合；回轉(zhuǎn)模擬失重同時加入出核轉(zhuǎn)運抑制劑LMB，檢測HUVECs胞質(zhì)和胞核中p53變化及LC3、p62和磷酸化p70S6K的表達，免疫熒光檢測LC3斑點聚集情況。
　　結(jié)果：
　　1.回轉(zhuǎn)24h、48h和72h后，HUVECs中LC3II與LC3I的比值均升高，p62均降低?；剞D(zhuǎn)48h后，HUVECs和PMVECs含LC3斑點（>5個）的細胞數(shù)目較對

8、照組顯著增多，透射電子顯微鏡觀察到回轉(zhuǎn)48h后HUVECs和PMVECs中自噬體和自噬溶酶體產(chǎn)生。
　　2.3-MA能有效逆轉(zhuǎn)模擬失重引起的HUVECs LC3II/LC3I比值升高及p62表達降低；與單純模擬失重組相比，模擬失重同時用3-MA阻斷自噬后，HUVECs細胞凋亡率升高，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達降低，Bax表達升高，活化的caspase3表達升高，Transwell實驗中細胞遷移率降低，劃痕愈合率下降。
　　3

9、.與地面正常重力對照組相比，回轉(zhuǎn)模擬失重48h后HUVECs LC3II/LC3I比值升高， p62和磷酸化p70S6K的表達均顯著降低，磷酸化AMPK變化不明顯；在正常重力條件下沉默p53會使HUVECs LC3II/LC3I比值升高，p62表達減少，p70S6K磷酸化減少，免疫熒光顯示LC3呈斑點狀聚集的細胞比例增高，而在模擬失重條件下過表達p53會逆轉(zhuǎn)失重引起的HUVECs的自噬增強。
　　4.回轉(zhuǎn)模擬失重48h后，HUVE

10、Cs中p53的mRNA水平變化不明顯，而胞質(zhì)和胞核中p53蛋白水平均顯著降低；沉默HDM2或者加入MG132均可逆轉(zhuǎn)模擬失重導(dǎo)致的HUVECs p53蛋白表達量減少、LC3II/LC3I比值升高、p62及磷酸化p70S6K降低、LC3呈斑點狀聚集的細胞比例升高等變化；免疫共沉淀顯示回轉(zhuǎn)48h后HUVECs HDM2與p53結(jié)合增強；模擬失重同時加入出核轉(zhuǎn)運抑制劑LMB后，HUVECs胞質(zhì)p53相較于對照組變少，而胞核p53與對照組相比無

11、明顯變化，LC3II/LC3I比值升高，p62表達減少，p70S6K磷酸化減少，免疫熒光顯示LC3呈斑點狀聚集的細胞比例增高。
　　結(jié)論：
　　1.回轉(zhuǎn)模擬失重可使HUVECs和PMVECs自噬增強。
　　2.自噬能部分抑制回轉(zhuǎn)模擬失重48h引起的HUVECs凋亡增高，并增強HUVECs的細胞遷移能力。
　　3. HUVECs在回轉(zhuǎn)模擬失重48h后p53表達下降進而使mTOR活性降低，并最終誘導(dǎo)自噬增強，這一過程

12、不依賴于AMPK的活性改變。
　　4.回轉(zhuǎn)模擬失重48h促進HUVECs中的p53與HDM2結(jié)合，隨后胞質(zhì)p53在26S蛋白酶體被降解，從而降低mTOR活性，使自噬水平升高。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)回轉(zhuǎn)模擬失重可引起大血管內(nèi)皮細胞和微血管內(nèi)皮細胞出現(xiàn)自噬增強，這種自噬的增強可部分抑制模擬失重誘導(dǎo)HUVECs的凋亡，促進內(nèi)皮細胞遷移。進一步研究發(fā)現(xiàn)，自噬增強的機制為回轉(zhuǎn)模擬失重可促進HUVECs胞質(zhì)中p53與HDM2的結(jié)合，進