丙肝和梅毒抗體的灰區(qū)標(biāo)本假陽性結(jié)果分析及梅毒抗體檢測方法改進(jìn)的研究.pdf

1、研究背景：
　　丙型肝炎和梅毒是常見血液傳播性疾病。丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus，HCV)感染可造成急性或慢性肝炎，會發(fā)展為肝硬化或肝癌。梅毒螺旋體（Treponema Pallidum,TP）感染可損害人體多系統(tǒng)多器官，導(dǎo)致組織破壞、功能喪失，甚至危及生命，并能母嬰傳播，威脅下一代健康。世界衛(wèi)生組織（World HealthOrganization,WHO）報告，丙肝和梅毒發(fā)病率呈逐年上升趨勢，現(xiàn)已成為嚴(yán)重的公

2、共衛(wèi)生問題。目前尚無能預(yù)防HCV和TP感染的有效疫苗。這兩種疾病感染初期往往無明顯的臨床癥狀和體征，易造成漏診，延遲治療。實(shí)驗(yàn)室結(jié)果作為主要臨床診斷指標(biāo)，結(jié)果準(zhǔn)確對臨床診療與阻斷疾病的傳播具有重要意義。
　　近年來，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）和化學(xué)發(fā)光免疫分析（Chemiluminescent immunoassay,CLIA）因其通量大、自動化程度高、易于標(biāo)

3、準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于無癥狀人群的篩查和疾病診斷。但許多研究表明，ELIA和CLIA兩種篩查試驗(yàn)均存在一定比例的假陽性，尤其在低感染流行人群中會出現(xiàn)較高的假陽性。假陽性結(jié)果會帶給受檢者不必要的就醫(yī)和心理傷害，需要引起重視。影響產(chǎn)生假陽性的因素目前尚不明確。不同檢測方法的假陽性率不同，這可能與方法使用的反應(yīng)體系、抗原成分和抗原表位等有關(guān)。TP47蛋白是梅毒螺旋體中豐度最高、抗原性強(qiáng)和特異性高的抗原，是用于檢測梅毒特異性抗體的主要抗原之一

4、。研究報道，TP47中有一段與人纖維連接蛋白有較高的同源性的序列，這可能和某些自身免疫性病人血清與梅毒檢測試劑發(fā)生交叉反應(yīng)有關(guān)。利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測特異性抗原表位，去掉特異性差的片段，降低引起交叉反應(yīng)的可能性。這種抗原表位的應(yīng)用可能會降低假陽性反應(yīng)，提高檢測方法的特異性。
　　研究目的：
　　1.探討Architect i2000和HISCL5000兩種化學(xué)發(fā)光方法檢測抗HCV抗體（Hepatitis C virus an

5、tibody,Anti-HCV）和抗TP抗體（Treponema Pallidum antibody,Anti-TP）灰區(qū)標(biāo)本的假陽性結(jié)果情況，為HCV和TP的診斷和治療提供應(yīng)用參考。
　　2.建立TP47E抗原表位蛋白和TP47全蛋白的雙抗原夾心ELISA，比較兩方法檢測梅毒抗體的敏感性和特異性，探索利用抗原表位解決假陽性問題方案的可行性。
　　研究方法：
　　1.收集本院Architect i2000檢測Anti-

6、HCV篩查陽性結(jié)果（1≤S/CO≤5）的樣本161例。全部樣本均進(jìn)行HISCL5000檢測。以高敏HCV核酸（Ribonucleic acid,RNA）定量和重組免疫印跡試驗(yàn)（Recombinant immuneblot assay,RIBA）的結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)確定真、假陽性。采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.收集本院Architect i2000檢測Anti-TP

7、篩查陽性結(jié)果（1≤S/CO≤10）的樣本334例。全部樣本均進(jìn)行HISCL5000檢測和梅毒螺旋體抗體明膠顆粒凝集試驗(yàn)（Treponema Pallidum particle agglutination assay，TPPA）檢測。兩種化學(xué)發(fā)光方法檢測結(jié)果不一致的標(biāo)本進(jìn)行RIBA檢測。以TPPA和RIBA的結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)確定真、假陽性。采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　

8、　3.利用EMBOSS、Bepipred和IEDB預(yù)測軟件進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測。根據(jù)上述預(yù)測軟件的結(jié)果，選取TP47的81-120的氨基酸序列作為優(yōu)勢抗原表位，應(yīng)用基因工程技術(shù)，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28b-TP47E，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定，并轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、鎳離子親和層析柱純化和免疫印跡法（Western Blot, WB）鑒定。
　　4.采用過碘酸鈉法標(biāo)記重組蛋白作酶標(biāo)抗原，以重組蛋白作包被

9、抗原，建立雙抗原夾心ELISA，優(yōu)化抗原包被濃度、包被方式、封閉條件、血清稀釋倍數(shù)、血清反應(yīng)時間、酶標(biāo)抗原濃度、酶標(biāo)抗原反應(yīng)時間和底物反應(yīng)時間等條件，并檢測46份TPPA陰性血清和91份Architect i2000檢測結(jié)果處于灰區(qū)的標(biāo)本（1≤S/CO≤10），比較TP47E抗原表位蛋白和TP47全蛋白的雙抗原夾心ELISA的敏感性和特異性。
　　研究結(jié)果：
　　1. HISCL檢測Anti-HCV結(jié)果陽性的標(biāo)本有23例，陰

10、性的有138例，兩化學(xué)發(fā)光法的Anti-HCV結(jié)果一致率為14.3％（23/161）。所有標(biāo)本的HCV RNA定量檢測結(jié)果均陰性。RIBA檢測13例結(jié)果陽性，45例不確定，103例陰性。Architect和HISCL與RIBA的總一致率分別為8.1%（13/161）和69.6%（112/161）， Architect假陽性標(biāo)本占其總陽性標(biāo)本的91.9%（148/161）；HISCL假陽性標(biāo)本占其總陽性標(biāo)本的52.2%（12/23）。HI

11、SCL方法檢測的標(biāo)本RIBA陽性組、不確定組和陰性組的平均COI值分別為3.0、1.0和0.2，三組間的COI值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000＜0.01）；Architect方法檢測的標(biāo)本RIBA陽性組、不確定組和陰性組的平均COI值分別2.8、2.2和2.0，三組間的S/CO值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.027＜0.05）。
　　2.HISCL檢測Anti-TP結(jié)果陽性的標(biāo)本有209例，陰性的有125例，兩化學(xué)發(fā)光法的Anti-

12、TP結(jié)果一致率為62.6%（209/334）。以TPPA為標(biāo)準(zhǔn)，Architect和 HISCL的結(jié)果與TPPA的總一致率分別為61.7%（206/334）和85.3%（285/334）。Architect假陽性標(biāo)本占其總陽性標(biāo)本的38.3%（128/334）；HISCL假陽性標(biāo)本占其總陽性標(biāo)本的12.4%（26/209）。TPPA陽性組和陰性組的Architect平均S/CO值、HISCL平均COI值分別為4.8和2.5、3.9和0.

13、8，兩組間的S/CO值或 COI值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均為 P=0.000＜0.01）。Architect陽性而HISCL陰性的125例標(biāo)本經(jīng)RIBA檢測，6.4%標(biāo)本陽性(8/125)，26.4%不確定(33/125)，67.2%陰性(84/125)。
　　3.綜合分析B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果，選取TP47位于81-120的氨基酸序列作為優(yōu)勢抗原表位，標(biāo)記為TP47E，其氨基酸序列為AFRQQFQYAVEVLGEK VLSKQETED

14、SRGRKKWEYETDPSV。PCR擴(kuò)增獲得編碼TP47E蛋白的基因序列，構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET28b-TP47E，測序結(jié)果表明，其堿基序列與GenBank中的基因序列一致，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、鎳離子親和層析柱純化和免疫印跡法獲得了重組TP47E抗原表位蛋白。
　　4.采用過碘酸鈉法標(biāo)記重組蛋白，獲得酶標(biāo)抗原。基于TP47E抗原表位蛋白和 TP47全蛋白建立的雙抗原夾心 ELISA，其最佳抗原包被濃度分別為1μg/mL和0.5

15、μg/mL、最佳包被方式為37℃2h后4℃過夜，最佳封閉條件為1%BSA和4℃過夜，最佳血清稀釋度為血清原液，最佳血清反應(yīng)時間為90min，最佳酶標(biāo)抗原濃度為1μg/mL，最佳酶標(biāo)抗原反應(yīng)時間為30min，最佳底物反應(yīng)時間為10min。TP47E的ELISA法的敏感性和特異性為81.3%（47/58）和94.0%（31/33），TP47的ELISA法的敏感性和特異性為93.2%（55/59）和78.8%（26/33）。
　　結(jié)論：

16、
　　1.Architect i2000和 HISCL5000兩種化學(xué)發(fā)光法檢測 Anti-HCV和Anti-TP的灰區(qū)標(biāo)本均出現(xiàn)較高假陽性，假陽性原因還需進(jìn)一步深入研究，迫切需要研發(fā)特異性更高的Anti-HCV和Anti-TP的實(shí)驗(yàn)室篩查方法。
　　2.本文成功建立了TP47E抗原表位和TP47全蛋白的雙抗原夾心ELISA方法并比較兩者的敏感性和特異性。TP47E抗原表位ELISA方法的敏感性不足，但與 TP47全蛋白比較