山羊痘熒光抗體檢測與PCR方法的建立.pdf

1、山羊痘(Goatpox,GP)是由羊痘病毒屬(Capripoxvirus)山羊痘病毒(Goatpoxvirus,GPV)引起的一種高度接觸性傳染病。臨床上以體溫升高，全身皮膚、呼吸道和消化道黏膜出現(xiàn)痘疹為主要特征。本病在印度、孟加拉、中東以及非洲中北部地區(qū)呈地方性流行，對養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重的危害和巨大經(jīng)濟損失。本病被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類重大傳染病，我國也將其列為國家一類動物疫病。 近年來，我國黑龍江、四川和云南等省份相

2、繼報道了山羊痘的發(fā)生與流行。2002年10月，本病在貴州省首次爆發(fā)，并波及了8個養(yǎng)羊較為集中的地區(qū)，發(fā)病率高達66.38％(2940/4429)，死亡率為42.06％(1863/4429)；2007年8月，貴州省某地區(qū)又一次爆發(fā)該病。為對山羊痘疑似病例作出確定性診斷，本研究開展了山羊痘血清學(xué)與分子生物學(xué)檢測方法的研究，取得了以下研究成果： 1.山羊痘熒光抗體試驗的建立：采用飽和硫酸銨鹽析法和SephadexG-25層析法從兔抗G

3、PV高免血清中提純IgG，標(biāo)記熒光素，制備了山羊痘直接熒光抗體，用于檢測感染細(xì)胞中的GPV抗原。結(jié)果表明，該方法能檢測出BHK-21感染細(xì)胞中的病毒抗原，熒光抗體的最適工作濃度確定為1:32，且這種熒光能夠被山羊痘標(biāo)準(zhǔn)陽性血清特異性抑制。用制備的熒光抗體分別檢測感染GPV標(biāo)準(zhǔn)弱毒株、疫苗株及貴州分離株的BHK-21細(xì)胞抹片和飛片，結(jié)果均為陽性，而正常細(xì)胞對照均為陰性。 2.基于P32基因PCR方法的建立及其基因序列分析：參照Ge

4、nBank已發(fā)表的GPV基因序列，針對P32基因設(shè)計與合成了1對特異性引物，成功地建立了針對P32基因的PCR方法。PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果證實該PCR方法具有較好的特異性；敏感性檢測顯示，其DNA模板最小檢出量為19.06×103Pg；利用該方法對貴州省臨床痘疹樣本進行現(xiàn)場檢測，其陽性檢出率為100％(10/10)。 采用GelExtractKit試劑盒回收純化P32基因，與pMD18-T克隆載體4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH

5、5a，經(jīng)PCR和酶切鑒定后送往大連寶生物工程有限公司進行序列測定，結(jié)果表明上述4株毒株的P32基因序列與國內(nèi)外羊痘毒株之間核苷酸的同源性為97.9％～100％，所推導(dǎo)氨基酸的同源性為96.2％～100％。 3.基于ITR基因PCR方法的建立及其基因片段序列分析：針對GPVITR基因設(shè)計與合成了1對特異性引物，成功地建立了針對ITR基因片段的PCR方法。經(jīng)PCR產(chǎn)物的酶切分析證實，該PCR方法亦具有較高的特異性；敏感性檢測顯示，其

6、DNA模板最小檢出量為24.40pg；用該方法對貴州省臨床痘疹樣本進行現(xiàn)場檢測，其陽性檢出率亦均為100％(10/10)。 回收ITR基因片段，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α，經(jīng)PCR和酶切鑒定后進行序列測定，結(jié)果表明上述4株毒株的ITR基因片段序列與國內(nèi)外羊痘毒株之間核苷酸的同源性為98.2％～100％，所推導(dǎo)氨基酸的同源性為96.5％～100％。 4.通過PCR的特異性與敏感性檢測以及基因序列的同源性比較分