生物活性透明質酸對LPS誘導的人樹突狀細胞和巨噬細胞炎癥應答的作用研究.pdf

1、研究目的：機體發(fā)生膿毒血癥時，Toll樣受體4（TLR4）信號通路參與固有免疫和急性炎癥的過程。因此，通過TLR4信號通路調節(jié)炎癥反應，被越來越多的研究者看作是臨床上治療膿毒血癥的新方向。小分子量的透明質酸（hyaluronic acid, HA）具有多種生物學功能，可刺激內皮細胞遷移、增殖和新生血管的形成，促進腫瘤細胞的生長和轉移，也可使損傷部位炎癥細胞聚集、釋放各種炎癥介質和細胞因子。然而，近年有研究者發(fā)現(xiàn)小分子量的透明質酸可發(fā)揮抗

2、炎作用。目前，小分子量的HA在炎癥效應中的作用尚無一致的定論，且其在炎癥反應中的作用機制也并不十分明確。在本實驗中，我們應用經(jīng)透明質酸酶PH20特殊處理的分子量為10～50 kDa的重組透明質酸（既生物活性透明質酸，bioactive hyaluronic acid, B-HA），觀察其對LPS刺激的人樹突狀細胞（Dendritic cell, DC）和巨噬細胞炎癥應答的影響，并探究其在炎癥應答中的作用機制。
　　研究方法：

3、>　　1.人外周血分離培養(yǎng)的成熟樹突狀細胞和THP-1細胞分化來源的巨噬細胞，經(jīng)不同濃度的B-HA預先孵育2小時，加終濃度為100ng/ml的LPS刺激4小時，收集細胞，提取細胞總RNA，實時熒光定量PCR方法檢測細胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10和IFN-βmRNA表達水平。確定B-HA的最適濃度。
　　2.THP-1分化來源的巨噬細胞用最適濃度的B-HA預先保護2小時，LPS刺激不同時間（分別為2小時

4、、4小時、8小時），提取細胞總RNA，實時熒光定量PCR方法檢測細胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10和IFN-βmRNA表達水平。
　　3.最適濃度的B-HA預先保護THP-1細胞分化來源的巨噬細胞2小時，LPS刺激8小時后，收集細胞培養(yǎng)上清，酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測細胞因子蛋白表達水平。
　　4. B-HA預先保護THP-1細胞分化來源的巨噬細胞2小時，LPS刺激不同時間（分別為15 m

5、in、30 min、60 min），提取細胞蛋白，western blot方法測定TLR4下游信號通路NF-κB、MAPKs、和IRF-3中蛋白分子的磷酸化水平改變情況。
　　研究結果：
　　1.在THP-1細胞分化來源的巨噬細胞實驗中，與LPS組相比，20 mg/ml B-HA不僅能抑制炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IFN-β的mRNA和蛋白表達水平，而且可增強抗炎因子IL-10的mRNA和蛋白表達水平

6、。B-HA對TLR4信號通路下游的NF-κB(IKK、IκB、p65)、MAPKs（JNK、ERK、p38）和IRF-3蛋白分子的磷酸化水平均有不同程度的抑制。
　　2.在人外周血分離培養(yǎng)的 DCs細胞實驗中，不同濃度的 B-HA對 LPS刺激的促炎因子（TNF-α、IL-6、IL-8）和抗炎因子（IL-10）均無明顯影響。
　　結論：
　　小分子量的B-HA能通過TLR4信號通路有效地調節(jié)人巨噬細胞中促炎因子和抗炎因