肺臟基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)不成熟樹突狀細(xì)胞為調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞的研究.pdf

1、本文建立了小鼠的肺臟成纖維細(xì)胞樣基質(zhì)細(xì)胞系，通過該細(xì)胞系與樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)的共培養(yǎng)體系來研究共培養(yǎng)后的DC的各種變化。 首先，取新生鼠的肺臟，用組織貼塊的方法得到了肺臟的基質(zhì)細(xì)胞，不斷傳代，大概在貼塊4個(gè)月后得到了一株比較均一的能夠穩(wěn)定傳代的成纖維樣細(xì)胞系。光鏡下，這株細(xì)胞呈扁平星狀或梭形，細(xì)胞核卵圓形，有1～2個(gè)核仁，細(xì)胞質(zhì)較多。透射電鏡下，該細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體和發(fā)達(dá)的

2、高爾基復(fù)合體。該細(xì)胞Cytokeratin和Desmin陰性，Vimentin陽性，CD31和vWF陰性，CD105和CD106陽性，MHCⅠ類分子陽性，MHCⅡ類分子和CD40及CD54陰性。用半定量RT-PCR和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)該基質(zhì)細(xì)胞高分泌M-CSF、TGF-β、VEGF、SCF、MCP-1、IP-10及SDF-1α等細(xì)胞因子和趨化因子。結(jié)合以上特點(diǎn)，認(rèn)為這是一株成纖維細(xì)胞樣的基質(zhì)細(xì)胞系。由于存在于肺臟中的DC多為不成熟DC，

3、因此將骨髓(BoneMarrow,BM)來源的用GM-CSF和IL-4培養(yǎng)了7天的CD11c+DC接種入基質(zhì)細(xì)胞。用GM-CSF和IL-4培養(yǎng)了7天的CD11c+DC細(xì)胞表面Ia、CD40、CD80、CD86的水平都比較低，具有較強(qiáng)的吞噬功能，因此可以認(rèn)為是一種不成熟DC,用來模擬體內(nèi)存在于肺臟的不成熟DC。將此不成熟DC與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，該基質(zhì)細(xì)胞支持不成熟DC的生長，可以使DC發(fā)生大量的增殖。為了排除其他細(xì)胞的污染，選用EGF

4、P小鼠(該小鼠所有有核細(xì)胞都表達(dá)GFP蛋白)來制備不成熟DC，我們分選了GFP+CD11c+Ia+的d7BMDC單個(gè)細(xì)胞種入基質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)90％的單個(gè)細(xì)胞發(fā)生了增殖，表明肺成纖維細(xì)胞樣的基質(zhì)細(xì)胞能夠支持不成熟DC的增殖。 為了觀察DC接種到基質(zhì)細(xì)胞上的變化，選用了GFP+DC，并對共培養(yǎng)后的GFP+DC的表型做了一個(gè)動(dòng)態(tài)檢測，發(fā)現(xiàn)隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長，DC的表面分子Ia、CD11c下調(diào)，CD11b、CD80上調(diào)，而CD40、

5、CD86的變化不大，最后穩(wěn)定在CD11clowIalowCD11bhigh的表型特征。鑒于細(xì)胞的這種表型特征，加上基質(zhì)細(xì)胞CD11b陰性，因此用CD11b作為共培養(yǎng)后這群細(xì)胞分離純化的標(biāo)志，用CD11b磁珠陽性選擇這群細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 為了分析這群細(xì)胞的特點(diǎn)，將這群CD11clowIalowCD11bhighDC細(xì)胞與接種入基質(zhì)細(xì)胞前的不成熟DC的吞噬功能、表型、細(xì)胞因子分泌譜、抗原提呈功能及對LPS的敏感性做了逐一的比較，結(jié)

6、果發(fā)現(xiàn)這群細(xì)胞在以上各個(gè)方面都不同于不成熟DC。不成熟DC在LPS刺激后則無論表型、細(xì)胞因子分泌譜還是功能均向成熟DC轉(zhuǎn)化，而這群細(xì)胞對LPS的刺激呈耐受狀態(tài)，LPS刺激前后無論表型、細(xì)胞因子分泌譜，還是功能變化都不大，這說明這群DC處在一種穩(wěn)定的狀態(tài)。從吞噬功能來看，CD11clowIalowCD11bhighDC的吞噬功能較弱；從細(xì)胞因子的分泌譜來看，CD11clowIalowCD11bhighDC自發(fā)分泌高量的IL-10、NO、P

7、GE2，而IL-12的分泌量很低；從抗原提呈功能來看，CD11clowIalowCD11bhighDC刺激抗原肽特異性T細(xì)胞增殖的能力很弱，但是它可以使T細(xì)胞分泌大量的IFN-γ并上調(diào)T細(xì)胞表面的活化標(biāo)志CD25和CD44。 鑒于CD11clowIalowCD11bhighDC的以上特點(diǎn)，推測該細(xì)胞可能具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用。將CD11clowIalowCD11bhighDC加入到OVA323-339抗原肽特異性-CD4+T/ma

8、DC/OVA323-339的共培養(yǎng)體系中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD11clowIalowCD11bhighDC有效地抑制了T細(xì)胞的增殖，從T細(xì)胞的絕對數(shù)目到T細(xì)胞CFSE標(biāo)記后的分裂增殖情況，都證實(shí)了CD11clowIalowCD11bhighDC確實(shí)顯著地抑制了抗原肽特異性T細(xì)胞的增殖。但是共培養(yǎng)體系上清中細(xì)胞因子的分泌量的檢測表明，加了CD11clowIalowCD11bhighDC后上清中IFN-γ和IL-2未見減少，對T細(xì)胞進(jìn)行IFN-γ和

9、IL-2胞內(nèi)染色及活化標(biāo)志CD25和CD44檢測后進(jìn)一步證實(shí)了CD11clowIalowCD11bhighDC確實(shí)不抑制T細(xì)胞的活化。因此我們將這群CD11clowIalowCD11bhighDC稱為調(diào)節(jié)性DC(regulatoryDC，DCreg)。 接著，探討了基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)不成熟DC向DCreg分化的機(jī)制。首先采用了Transwell系統(tǒng)，將不成熟DC直接加入預(yù)先鋪有基質(zhì)細(xì)胞的24孔板中或加入到基質(zhì)細(xì)胞上方的Transwel

10、l小室中，7天后比較DC的數(shù)量及其功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Transwell上得到DC量大大少于與基質(zhì)細(xì)胞直接接觸組的DC量，這說明DCreg細(xì)胞的增殖是接觸依賴的；而從細(xì)胞的抑制功能上來看，兩組細(xì)胞都能有效地抑制T細(xì)胞的增殖，且抑制的水平?jīng)]有顯著差異，這說明基質(zhì)細(xì)胞的可溶性因子就足以使不成熟DC在抑制功能上向DCreg轉(zhuǎn)化。為了進(jìn)一步探討可溶性因子中參與不成熟DC向DCreg轉(zhuǎn)化的組分，結(jié)合基質(zhì)細(xì)胞分泌的各種因子，向共培養(yǎng)體系中分別加入了VEG

11、F、TGF-β及M-CSF的中和性抗體，7天后將共培養(yǎng)后的DC從共培養(yǎng)體系中分離出來，并研究其抑制T細(xì)胞增殖的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這幾種中和性抗體處理后得到的DC仍舊具有很強(qiáng)的抑制功能，這說明VEGF、TGF-β及M-CSF都不是促使不成熟DC向DregC分化的因素。 研究了這群調(diào)節(jié)性DC這方面的功能。將DCreg或成熟DC與GFP+的OVA323-339抗原肽特異性CD4+T細(xì)胞在抗原肽存在的情況下共培養(yǎng)，7天后，CD4磁珠陽性選擇

12、共培養(yǎng)后GFP+CD4+T細(xì)胞，再用maDC和OVA323-339刺激之，觀察T細(xì)胞增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)調(diào)節(jié)性DC誘導(dǎo)后的GFP+CD4+T細(xì)胞增殖微弱，其增殖反應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于用成熟DC誘導(dǎo)后的CD4+T細(xì)胞的增殖反應(yīng)，這說明DCreg誘導(dǎo)了T細(xì)胞的低反應(yīng)性。 為了檢驗(yàn)這群T細(xì)胞的功能，又將經(jīng)DCreg誘導(dǎo)了7天的GFP+T細(xì)胞加到OVA323-339抗原肽特異性GFP-CD4+T/maDC/OVA323-339的共培養(yǎng)體系中，觀

13、察GFP-CD4+T細(xì)胞的增殖反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GFP+CD4+T顯著地抑制了GFP-CD4+T細(xì)胞的增殖反應(yīng)，且抑制作用存在細(xì)胞濃度依賴性，這說明這群T細(xì)胞具有抑制T細(xì)胞增殖的功能，從而提示這群T細(xì)胞有可能是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。 為了確定調(diào)節(jié)性DC誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的類型，進(jìn)一步分析了這群T細(xì)胞的表型及細(xì)胞因子分泌譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這群T細(xì)胞高分泌TGF-β、IL-10、IFN-γ及少量的IL-2和IL-4，通過Transwell及IL-1

14、0和TGF-β中和性抗體阻斷實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)該T細(xì)胞不是通過細(xì)胞接觸，也不是通過其分泌的TGF-β或IL-10發(fā)揮抑制T細(xì)胞增殖作用，而是通過上清中一些未知的成分發(fā)揮了抑制效應(yīng)。因此我們認(rèn)為這群T細(xì)胞是不同于Tr1或Th3的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。 為了明確在體外培養(yǎng)的調(diào)節(jié)性DC是否在體內(nèi)存在相應(yīng)的亞群，根據(jù)該調(diào)節(jié)性DC的表型特點(diǎn)，分析了肺臟單個(gè)細(xì)胞懸液。該調(diào)節(jié)性DC最重要的特點(diǎn)就是高表達(dá)CD11b、低表達(dá)CD11c及Ia，因此我們用CD1

15、1b-FITC、CD11c-PE-Cy7及Ia-PE三色標(biāo)記肺臟的單個(gè)細(xì)胞懸液，F(xiàn)ACS分析發(fā)現(xiàn)肺臟內(nèi)確實(shí)存在著這樣一群CD11bhighCD11clowIalow的細(xì)胞，且占了CD4-CD8-B220-GrTNK1.1-肺單個(gè)核細(xì)胞的4.2％左右。采用FACSvantage將這群細(xì)胞分選出來，進(jìn)行了功能研究，發(fā)現(xiàn)這群細(xì)胞與體外培養(yǎng)的調(diào)節(jié)性DC一樣也能抑制T細(xì)胞的增殖，且抑制率達(dá)到了50％以上。以上說明肺臟內(nèi)確實(shí)存在一群表型和功能與MP

16、SC誘導(dǎo)產(chǎn)生的DCreg相似的細(xì)胞亞群。 為了明確體外培養(yǎng)的調(diào)節(jié)性DC能否在體內(nèi)發(fā)揮抑制T細(xì)胞增殖的效應(yīng)，加上調(diào)節(jié)性DC在體外刺激T細(xì)胞分泌IFN-γ，且抑制Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)而不抑制Th1型細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ)的分泌，復(fù)制了小鼠的哮喘模型，誘導(dǎo)了Th2型細(xì)胞介導(dǎo)的氣道嗜酸性粒細(xì)胞性炎癥。發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性DC體內(nèi)回輸后能有效地抑制哮喘模型肺泡灌洗液和肺實(shí)質(zhì)中的白細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤，降低肺泡灌洗液