人不成熟樹突狀細(xì)胞體外擴(kuò)增及低溫凍存的研究.pdf

1、在大面積深度燒傷患者的救治工作中，及時(shí)有效的創(chuàng)面覆蓋是治療的關(guān)鍵。同種異體皮膚移植為創(chuàng)面覆蓋提供了良好的思路。但目前臨床上移植后的排斥反應(yīng)嚴(yán)重影響了治療效果。免疫抑制劑可以延長(zhǎng)異體皮的存活時(shí)間，但大劑量抗排斥藥物的應(yīng)用同時(shí)增加了患者感染的危險(xiǎn)性。通過(guò)攜帶供者抗原的不成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)異基因皮膚移植耐受為延長(zhǎng)異體皮成活時(shí)間的有效途徑。 樹突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞(antigen-pr

2、esentingcell，APC)，是天然免疫和獲得性免疫的重要調(diào)節(jié)劑。在樹突狀細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中，不成熟樹突狀細(xì)胞(immaturedendriticcell，imDC)與成熟DC(maturedendriticcell，mDC)在表型特征以及生物學(xué)功能上都有區(qū)別。imDC由于其細(xì)胞表面缺乏MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子，在免疫應(yīng)答過(guò)程中非但不能激活T細(xì)胞，反而能誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞無(wú)能或凋亡，在誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受中發(fā)揮了重要作用。i

3、mDC穩(wěn)定性差，在正常培養(yǎng)條件下難以長(zhǎng)期保存，臨床上使用的異體皮都來(lái)自死后捐贈(zèng)者，同時(shí)燒傷發(fā)生具有極大的偶然性，如何長(zhǎng)期有效的保存攜帶供者抗原的不成熟樹突狀細(xì)胞并保持其不成熟特性成為問(wèn)題的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)研究臍血來(lái)源的不成熟樹突狀細(xì)胞低溫凍存前后所表現(xiàn)的生物特性，為不成熟樹突狀細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供保存方法。 在本研究中，我們?nèi)⌒迈r臍血分離單個(gè)核細(xì)胞，在體外經(jīng)粒系—巨噬細(xì)胞系集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)誘導(dǎo)產(chǎn)生不成

4、熟樹突狀細(xì)胞，加10％二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)/5％二甲基亞砜(DMSO)+6％羥乙基淀粉(hydroxyethylstarch，HES)作為保護(hù)劑，-80℃冰箱降溫，-196℃保存，35～40℃水浴復(fù)溫，獲得凍存不成熟樹突狀細(xì)胞。光鏡下觀察臺(tái)盼藍(lán)拒染回收率；電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞表面成熟標(biāo)志(CD80、CD83和CD86)；混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixedlymphocytereact

5、ion，MLR)檢測(cè)兩組細(xì)胞刺激未致敏T淋巴細(xì)胞增殖能力。 主要結(jié)果： 1.培養(yǎng)細(xì)胞體積增大，表面可見(jiàn)毛刺樣不規(guī)則突起，電鏡下細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面粗糙，明顯可見(jiàn)突起及皺襞；細(xì)胞表型具有典型的DC特征(CD1a、CD14、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá)率分別為62.49％，18.28％，12.46％，4.60％，11.51％，67.4％)；混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)中細(xì)胞不能刺激同種未致敏T淋巴細(xì)胞增殖。

6、 2.應(yīng)用高濃度DMSO作保護(hù)劑的凍存不成熟樹突狀細(xì)胞和應(yīng)用低濃度DMSO的細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)拒染回收率(trypanbluerecoveryrate，TBRR)均大于85％，其細(xì)胞形態(tài)、成熟相關(guān)表型抗原(CD80、CD83和CD86)并未發(fā)生明顯改變；不能刺激同種未致敏T淋巴細(xì)胞增殖的能力與新鮮不成熟樹突狀細(xì)胞無(wú)顯著性差異。 主要結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)獲得的不成熟樹突狀細(xì)胞細(xì)胞具有典型的DC形態(tài)，在細(xì)胞表型和細(xì)胞功能試驗(yàn)