人脾臟基質細胞誘導新型調節(jié)性樹突狀細胞亞群的產生及其相關機制研究.pdf

1、樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)被認為是目前已知的功能最強大的專職抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APC)，能夠感知、整合一系列的外來病原體信號并將其傳遞給淋巴細胞，啟動適度的免疫應答反應以清除入侵機體的病原體。未成熟DC在微生物感染或移植后識別、吞噬外源性抗原，可快速成熟。DC成熟后吞噬能力減弱，但細胞表面共刺激分子和粘附分子的表達上調，并分泌促炎癥細胞因子，啟動初始的T細胞介導的免疫應

2、答反應。近年來，越來越多的研究表明DC是一種異質性的細胞群體，分布于不同的解剖部位，含有不同的細胞亞群，處于不同的成熟階段，表達不同的表型和細胞因子，其功能也是多樣性的。其中，具有負向免疫調控作用的DC亞群的發(fā)現及其功能特點與作用機制的研究是該領域近年來的重要進展之一，此類具有負向免疫調控作用的DC亞群被稱為調節(jié)性DC(Regulatroy DC)。目前認為，調節(jié)性DC主要通過選擇性的誘導Th2型的免疫應答或促使初始CD4+和CD8+T

3、細胞分化為分泌IL-10的調節(jié)性T細胞來負向調控免疫應答。
　　 在前期的研究中，以小鼠為實驗對象，我們發(fā)現以往被認為終末分化細胞的成熟DC，與小鼠脾臟基質細胞共培養(yǎng)后能夠進一步增殖并分化為一類能夠通過分泌NO而抑制T細胞增殖的新型調節(jié)性樹突狀細胞，我們將之命名為“分化樣樹突狀細胞”(Differentiated dendritic cell，diffDC)，從而提出了成熟DC并非均為終末分化細胞的觀點，其在完成了抗原遞呈任務之

4、后，在次級淋巴器官微環(huán)境的作用下，仍能夠進一步增殖分化，從而被賦予了新的生命與功能。在不同的生理或病理情況下，diffDC與周圍很多免疫細胞存在相互作用，彼此精密調節(jié)，例如可以通過分泌IL-10活化NK細胞而促進其殺傷能力，并通過分泌IP-10選擇性地趨化Th1細胞并抑制其增殖，從而維持機體的穩(wěn)態(tài)。然而，上述觀點都是來自于針對小鼠的實驗結果，在人體內成熟樹突狀細胞與脾臟基質微環(huán)境又是如何作用的呢?是否會產生像小鼠diffDC那樣的具有負

5、向調節(jié)功能的人樹突狀細胞亞群呢?如果真有這樣一種人DC亞群，其生物學意義及其相關的作用機制又是什么呢?
　　 鑒于本課題本質為兩種細胞的相互作用，我們在本研究中分為三部分內容，分別圍繞脾臟基質細胞系的建立、新型人調節(jié)性樹突狀細胞亞群的特點與功能以及該細胞亞群的人體內驗證三方面進行探討。
　　 一、人脾臟基質細胞系HESSCs的建立與鑒定
　　 首先，我們分離4-6月引產胎兒新鮮脾臟，用組織培養(yǎng)法培養(yǎng)脾臟基質細胞。

6、大約一個月左右，貼壁生長的基質細胞鋪滿培養(yǎng)板，消化傳代后形成最初的脾臟基質細胞系。此時的脾臟基質細胞系在鏡下觀察可見由數種形態(tài)、大小不一的細胞組成，純度不佳。隨著進一步的培養(yǎng)，逐步純化為主要由內皮狀細胞組成的基質細胞系，細胞生長速度趨于穩(wěn)定，如此經過大約2-3月的培養(yǎng)后，形成穩(wěn)定的脾臟基質細胞系。
　　 接下來，我們對所建的人類脾臟基質細胞系進行了初步鑒定，通過流式檢測分析發(fā)現該細胞系主要是由CD105+的內皮細胞組成，不表達C

7、D11c、CD11b等髓系細胞標志。mRNA分析表明該基質細胞系以內皮型細胞為主，檢測通過ELISA檢測發(fā)現該細胞系分泌較高的TGF-β，提示該細胞系可能具有一定的誘導分化能力，因此我們構建的脾臟基質細胞系是一群主要由內皮細胞構成的具有潛在誘導分化能力的基質細胞系，我們稱其為HESSCs(Human Endothelial-like Spleen Stromal Cells)。
　　 二、HESSCs誘導產生的新型人調節(jié)性樹突狀

8、細胞亞群的特點與功能
　　 在本部分實驗中，我們著重研究了由人脾臟基質細胞系HESSCs誘導的，從人外周血單核細胞來源的成熟樹突狀細胞分化而來的CD11bhiCTLA-4+新型人調節(jié)性樹突狀細胞亞群的特點與功能。
　　 首先，我們從正常人外周血樣本分離得到人外周血單個核細胞(PBMC)，進一步純化為CD14+單核細胞，用GM-CSF及IL-4聯合誘導其分化為典型的未成熟樹突狀細胞(imDC)，再用TLR配體LPS刺激其分

9、化為成熟樹突狀細胞(maDC)后，將該maDC與之前建立的脾臟基質細胞系HESSC混合培養(yǎng)，觀察二者之間的相互作用。實驗發(fā)現，去除誘導性細胞因子GM-CSF及IL-4后，對照培養(yǎng)基中的maDC大部分在1-2周內凋亡或死亡，而大部分與HESSCs混合培養(yǎng)的樹突狀細胞依舊存活，說明HESSCs支持單核細胞來源的maDC的存活。
　　 基于上述現象，我們選定與HESSC共培養(yǎng)1-2周后的maDC作為研究對象，進行表型與功能方面的檢測。

10、經流式分析發(fā)現這些細胞相對于maDC主要表現為CD11clow、CD11bhi、HLA-DRlow、CD80low、CD83low、CD86low及CTLA-4+，同時細胞因子檢測證實該群細胞高分泌PGE2、TGF-β，然而目前尚未發(fā)現該群細胞能夠分泌較高的IL-1O、NO等負向調節(jié)因子。令人感興趣的是，該群細胞表達抑制性受體CTLA-4，加之其又能分泌高水平的PGE2、TGF-β等負向調節(jié)細胞因子，提示該群新型樹突狀細胞亞群可能發(fā)揮著

11、一定的免疫抑制功能。通過對maDC及該新型樹突狀細胞亞群的mRNA進行分析對比，驗證了該群新型樹突狀細胞亞群TGF-β、CTLA-4的mRNA表達水平都明顯高于maDC，同時尚未發(fā)現該樹突狀細胞亞群的IL-10、PD-1、PDL-1、PDL-2等重要分子的mRNA水平有明顯增高。
　　 樹突狀細胞作為最主要的抗原提呈細胞，在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調控作用，那么我們這群新型的樹突狀細胞亞群在炎癥狀態(tài)下又有怎樣的反應昵?實

12、驗證明，該新型樹突狀細胞亞群與maDC相比在TLR4配體LPS刺激后，能夠分泌高水平的炎性細胞因子，包括IL-10、TNF-α、PGE2、TGF-β等。這一結果提示我們該新型樹突狀細胞亞群可能在炎癥狀態(tài)下發(fā)揮著更大的免疫調節(jié)作用。
　　 由HESSCs誘導的這群新型調節(jié)性樹突狀細胞表達CTLA-4，而CTLA-4作為重要的負向調節(jié)分子，在抑制T細胞免疫應答過程中發(fā)揮重要作用，因此我們推測該新型樹突狀細胞亞群可能具有免疫抑制的功能

13、。通過體外混合淋巴反應實驗，我們發(fā)現該新型DC亞群確實能夠顯著抑制maDC刺激后異體CD4+T細胞的增殖，具體的機制還有待于進一步研究。
　　 眾所周知，DC在未成熟狀態(tài)下具有極強的吞噬能力，當其遇到刺激或吞噬抗原分化成熟后吞噬能力就基本喪失。而由成熟DC分化而來的該新型DC亞群的吞噬能力卻又大大增強，這一現象為我們對其功能的深入研究探討提供了極大的想象空間。
　　 總之通過上述實驗，發(fā)現脾臟基質細胞系HESSCs可以誘

14、導外周血單核細胞來源的maDC分化為一種高分泌PGE2、TGF-β等調節(jié)性因子的具有獨特表型CD11bhiCTLA-4+的新型人調節(jié)性樹突狀細胞亞群。我們初步將其命名為CD11bhiCTLA-4+DCreg。
　　 三、人體內新型調節(jié)性樹突狀細胞亞群的鑒定
　　 在本部分研究工作中，我們著重在人體脾臟內尋找并初步驗證了這類新型調節(jié)性樹突狀細胞的存在。
　　 為了驗證該新型DC亞群是否真的存在于體內，我們在人脾臟中

15、尋找該DC亞群。我們首先用該新型DC亞群的特異性表面標志(CD11c+CD11bhiCTLA-4+)將表型相同的細胞分選出來，再通過檢測它的細胞因子分泌情況及其抑制功能來判斷人體內是否存在這樣一群還未被人們發(fā)現的DC亞群。
　　 我們用流式分選儀將人體脾臟內CD11c+細胞分選為CD11chiHLA-DRhiCD11blow、CD11chiHLA-DRhiCD11bhi和CD11cintHLA-DRlowCD11bhi三個細胞亞

16、群來研究，經過對細胞表型、混合淋巴反應、細胞因子分泌及吞噬能力多個方面進行檢測對比，證實人體脾臟內存在一群CD11chiHLA-DRhiCD11bhi的細胞表達CTLA-4，且分泌大量的PGE2、TGF-β、IL-10等細胞因子，具有較強的吞噬能力，在所占比例較大的情況下可以有效抑制體外maDC誘導的異體CD4+T淋巴細胞的增殖。因此我們初步判斷人脾臟內CD11chiHLA-DRhiCD11bhi細胞與體外脾臟基質細胞系HESSCs誘導

17、分化的CD11bhiCTLA-4+DCreg具有相似的特點與功能。
　　 綜上所述，我們通過實驗發(fā)現，人脾臟基質細胞系HESSCs可以誘導人外周血單核細胞來源的成熟DC分化為一群具有負向免疫調節(jié)作用的新型人樹突狀細胞亞群。該細胞亞群具有獨特的細胞表型CD11bhiCTLA-4+，高分泌PGE2、TGF-β等負向調節(jié)性因子，能夠有效抑制CD4+T淋巴細胞的增殖，并初步驗證了其在人體(脾臟)內的存在。這些實驗結果豐富了對免疫微環(huán)境負