胰島素對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的影響和急性心肌梗死患者循環(huán)中樹(shù)突狀細(xì)胞變化的研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)及其引起的臨床后果，如冠心病，已經(jīng)成為當(dāng)今社會(huì)威脅人類健康的頭號(hào)殺手。近年的研究發(fā)現(xiàn)在AS病變斑塊內(nèi)發(fā)現(xiàn)有大量免疫細(xì)胞的聚集，如巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DCs)等，多種內(nèi)源性抗原和外源性抗原引起的免疫反應(yīng)可促進(jìn)AS的形成，因此有學(xué)者甚至提出AS實(shí)質(zhì)上是一種自身免疫炎癥反應(yīng)性疾病。DCs是功能最強(qiáng)的專職性抗原遞呈細(xì)胞(Antigen p

2、resentation cell，APC)，也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能激活初始型T淋巴細(xì)胞的APC，是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動(dòng)者，在特異性細(xì)胞免疫和體液免疫中均起著十分重要的作用。隨著DCs在血管組織中的發(fā)現(xiàn)，DCs在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、發(fā)展中的作用受到廣泛關(guān)注。近年來(lái)研究多種公認(rèn)的致AS危險(xiǎn)因素(如氧化型低密度脂蛋白(ox—LDL)、熱休克蛋白(HSP)、尼古丁、高糖、糖基化終產(chǎn)物、微生物等)都可促使DCs免疫功能成熟；由于代謝綜合癥患者發(fā)生冠

3、心病等動(dòng)脈粥樣硬化病變的機(jī)率明顯增高，胰島素抵抗(Insulin resistence，IR)及高胰島素血癥也被認(rèn)為是AS的重要危險(xiǎn)因素之一，而近年來(lái)炎癥免疫被認(rèn)為在IR發(fā)生中起著重要作用，但其引起AS機(jī)制尚不清楚；本研究首先在體外以高濃度胰島素為干預(yù)因素，觀察對(duì)人單核細(xì)胞源性DCs成熟的影響，并探討其可能機(jī)制。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)在不穩(wěn)定AS斑塊中DCs聚集明顯增多，且多集中在AS斑塊的肩部，提示DCs參與的炎癥免疫反應(yīng)可能在AS的發(fā)生

4、和斑塊不穩(wěn)定性的形成及斑塊破裂的過(guò)程中起了重要作用，我們觀察了急性心肌梗死患者循環(huán)中DCs及其亞型變化，從而進(jìn)一步探討DCs參與的炎癥免疫反應(yīng)在AS發(fā)病機(jī)制中的作用。本研究從細(xì)胞水平和臨床流行病學(xué)等角度研究 DCs在AS免疫機(jī)制中的作用，全文由二個(gè)部分組成。 第一部分高濃度胰島素對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞分化成熟的影響及其機(jī)制研究 目的：胰島素抵抗(IR)及高胰島素血癥是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，但其引起AS機(jī)制尚不明確

5、。樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DCs)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的專職性抗原提呈細(xì)胞(APC)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)DCs參與了AS的免疫炎癥反應(yīng)的過(guò)程。本文探討胰島素對(duì)人單核源的樹(shù)突狀細(xì)胞(monoeytederived dendritic cells，MoDCs)分化成熟、免疫功能的影響及其作用機(jī)制。 方法：采用免疫磁珠法分離人外周血CD14<'+>單核細(xì)胞，在含重組人粒-單核細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF，100ng

6、/ml)和重組人白細(xì)胞介素-4 (rhIL-4，20ng/ml)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)五天使其分化為MoDCs，然后加入1nM、10nM、100nM濃度的胰島素干預(yù)24小時(shí)，另用磷脂酰肌醇3激酶(P13K)抑制劑(LY294002)及絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)抑制劑(PD98059)干預(yù)1小時(shí)后再加入10nM、100nM濃度的胰島素干預(yù)24小時(shí)，以磷酸鹽緩沖液(PBS)作為陰性對(duì)照組，以脂多糖(LPS)作為陽(yáng)性對(duì)照組，干預(yù)24h后采用流

7、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs表型(CD83、CD86)；FITC標(biāo)記的Dextran檢測(cè)DCs吞噬功能；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白介素-12(IL-12)等細(xì)胞因子的濃度。 結(jié)果：與PBS對(duì)照，10nM、100nM濃度的胰島素明顯上調(diào)了MoDCs表面CD83及共刺激分子CD86的表達(dá)(P<0.05)，且10nM、100nM濃度的胰島素促進(jìn)MoDCs分泌細(xì)胞因子TNF-α、I

8、FN-γ和IL-12，10nM的胰島素減弱了MoDCs的吞噬功能的作用；而1nM的胰島素則沒(méi)有這種作用；PD98059及LY294002干預(yù)后使10nM、100nM濃度胰島素上調(diào)CD83及CD86表達(dá)及促進(jìn)TNF-α、IFN-γ和IL-12分泌的作用明顯減弱(P<0.05)。 結(jié)論：高濃度胰島素促進(jìn)了樹(shù)突狀細(xì)胞分化及免疫功能的成熟，這種作用是通過(guò)MAPK及P13K兩條途經(jīng)起作用的；高濃度胰島素可能通過(guò)促進(jìn)DC免疫功能成熟參與了A

9、S免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。 第二部分急性心肌梗死患者循環(huán)中樹(shù)突狀細(xì)胞及其亞型變化的研究 目的：近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DCs)參與了動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的免疫炎癥反應(yīng)的過(guò)程。人的外周循環(huán)中主要有兩類樹(shù)突狀細(xì)胞：髓樣樹(shù)突細(xì)胞(mDC)和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(pDC)；多種自身免疫系統(tǒng)疾病都伴有循環(huán)DCs及其亞型的改變。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，DCs參與的炎癥免疫反應(yīng)可能與動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的形成密切

10、相關(guān)，本研究對(duì)不穩(wěn)定斑塊引起的極端狀態(tài)一急性心肌梗死患者外周循環(huán)中DCs及其亞型改變進(jìn)行了研究。 方法：在我院心內(nèi)科住院冠心病患者 31例，其中ST段抬高型急性心肌梗死17例(發(fā)病24小時(shí)內(nèi))，穩(wěn)定型心絞痛患者14例(診斷依據(jù)病史，心電圖，心肌酶學(xué)和冠脈造影)；以性別年齡相匹配的15例冠狀動(dòng)脈造影正常者為對(duì)照。采用流式細(xì)胞儀三色分析方法測(cè)定三組人群中外周血中DCs數(shù)目及其亞型的絕對(duì)數(shù)和百分?jǐn)?shù)，其中DCs以Lin1<'->HLA-

11、DR<'+>確定，mDC以Lin1<'->HLA-DR<'+>CD11c<'+>確定，pDC以Lin1<'->HLA-DR<'+>CD123<'+>確定：其中ST段抬高型心肌梗死患者在心肌梗死發(fā)作后7天進(jìn)行隨訪。并用ELISA法檢測(cè)各組患者外周血IL-6、和TNF-α水平。 結(jié)果：在急性ST段抬高型心肌梗死組、穩(wěn)定型心絞痛及正常對(duì)照組中mDC占外周血單個(gè)核細(xì)胞的百分比分別為0.037±0.035％，0.223±0.016％，0.

12、229±0.015％，三組中mDC的絕對(duì)數(shù)分別為3.78±0.85/μl，14.5±1.34/μl，14.84±0.97/μl，pDC所占的比例為0.018±0.023％，0.039±0.005％，0.056±0.006％，絕對(duì)數(shù)分別為1.51±0.46/μl，2.25±0.36/μl，3.29±0.31/μl，其中ST段抬高型心肌梗死患者mDC與pDC占外周血單個(gè)核細(xì)胞的比值及其絕對(duì)值較正常對(duì)照組和穩(wěn)定型心絞痛患者組均明顯下降(P均<

13、0.01)，穩(wěn)定型心絞痛組與正常對(duì)照組間外周血中mDC所占比例的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而pDC在外周血中所占的比例明顯下降(P<0.05)。在急性心肌梗死組一周后復(fù)查，mDC及pDC所占的百分比分別為0.214±0.102％和0.053±0.033％，兩者絕對(duì)數(shù)分別為14.99±2.05/μl和3.67±0.87/μl，在心肌梗死急性期(<24h)比較明顯增加(P均<0.01)。在心肌梗死急性期患者血清中細(xì)胞因子FNF-α(61.4±10