耐冷酵母Guehomyces pullulans17-1菌株乳糖酶的研究.pdf

1、乳糖酶（β-D-半乳糖苷酶，β-D-galactoside-galactohydrolase，EC3.2.1.23）為一種水解酶，可以將乳糖水解為葡萄糖和半乳糖，目前廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、環(huán)保等領(lǐng)域。冷適應(yīng)乳糖酶具有在低溫下高活性的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用在乳品加工和乳清引起的環(huán)境污染治理等方面，有著中溫和高溫乳糖酶無法達(dá)到的優(yōu)越性。同時(shí)南極地區(qū)被認(rèn)為是一個(gè)潛在的、重要的微生物資源庫，可能是產(chǎn)生新型生物活性物質(zhì)和先導(dǎo)化合物菌株的潛在種源地。我們實(shí)驗(yàn)室

2、從采集自南極的海泥樣品中篩選到33株酵母菌，本實(shí)驗(yàn)在15℃條件下，采用X-gal定性試驗(yàn)和ONPG定量試驗(yàn)從這33株酵母中篩選產(chǎn)乳糖酶的菌株，結(jié)果篩選到1株高產(chǎn)乳糖酶菌株17-1，經(jīng)酵母菌常規(guī)方法和分子生物學(xué)方法鑒定，我們將其鑒定為一株普魯蘭久浩酵母(Guehomyces pullulans)。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，G. pullulans17-1菌株可同時(shí)產(chǎn)胞外和與細(xì)胞結(jié)合的(Cell-bound)乳糖酶，根據(jù)溫度對菌體生長的影響

3、，我們判定菌株17-1為一株耐冷型酵母。對耐冷酵母G. pullulans17-1菌株產(chǎn)乳糖酶的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳培養(yǎng)基成分為(w/v)：乳糖3.0％，酵母粉0.7％，蛋白胨0.3％，紫蘇油0.02％，KH2PO40.28％，MgSO4·7HO20.06％，MnSO4·3HO20.00085％，培養(yǎng)基初始pH為4.5，蒸餾水配制；最佳培養(yǎng)條件為：15℃、170rpm振蕩培養(yǎng)132h，此時(shí)耐冷酵母G. pullulan

4、s17-1菌株乳糖酶總產(chǎn)量可達(dá)13.9U/mL。對發(fā)酵罐高密度發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了初探，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明可以將該乳糖酶的總產(chǎn)量提高到25.3U/mL。用粗酶樣品水解乳糖溶液，水解產(chǎn)物為葡萄糖和半乳糖，水解牛奶可產(chǎn)生大量還原糖。
　　 G. pullulans17-1菌株胞外乳糖酶經(jīng)超濾法濃縮、SephadexTMG-200凝膠過濾、CM-Sepharose F.F.陽離子交換層析得到了純化，比活力提高2.4倍。SDSPAGE顯示其單亞

5、基分子量約為170.0kDa，用凝膠過濾層析法測得該純化酶的分子量約為335.0kDa，因此推測G pullulans17-1菌株乳糖酶是一個(gè)同源二聚體。對該純化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：其最適作用溫度和pH分別為50℃和4.0，受Ag+、Hg2+的強(qiáng)烈抑制(8.2％，8.4％)，Li+離子對它有一定激活作用，對底物ONPG的Km值和Vmax分別為3.3mM和9.2μmol/min。一級蛋白質(zhì)譜分析表明，該乳糖酶的一個(gè)肽片ALE