共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的研究.pdf

1、共固定化酶是近年來(lái)興起的一項(xiàng)新技術(shù)，具有發(fā)揮多種酶的協(xié)同作用，能夠?qū)崿F(xiàn)底物到產(chǎn)物的一步轉(zhuǎn)化等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注和研究。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的共固定化及其在乳果糖制備中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文分別選用明膠和多孔玻璃為載體制備共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶，旨在將其應(yīng)用于乳果糖的酶法生產(chǎn)，為乳果糖的制備提供一條新的途徑。 研究和建立了乳果糖的快速測(cè)定方法：薄層層析法(TLC)。確立了最佳的薄層鋪板調(diào)漿劑為

2、硅膠G+0.05％羧甲基纖維素鈉+O.1mol/L磷酸二氫鈉，展開(kāi)劑為正丁醇：乙醇：水=5:3:2(體積比)，顯色劑為苯胺-二苯胺-磷酸溶液，薄層掃描儀的波長(zhǎng)為526nm。結(jié)果表明用薄層層析-薄層掃描法測(cè)定乳果糖，精密度和穩(wěn)定性較好，回收率符合要求，能夠滿(mǎn)足一般檢測(cè)的需要，可以作為乳果糖大批量半定量檢測(cè)的有效方法。采用HPLC法分析了反應(yīng)產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)高效液相色譜法(HPLC)和TLC相比靈敏度、精密度更高，準(zhǔn)確性相當(dāng)，但檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)、

3、成本較高。 對(duì)比了開(kāi)孔明膠、卡拉膠和明膠，選擇明膠為固定化載體，通過(guò)先包埋再交聯(lián)的方法共固定乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶。以固定化酶的活力回收率為指標(biāo)，研究確定了最佳的固定化條件為：pH8.6，明膠的質(zhì)量濃度為23％，前交聯(lián)戊二醛的體積分?jǐn)?shù)為0.15％，后交聯(lián)戊二醛的體積分?jǐn)?shù)為O.15％，后交聯(lián)溫度4℃，后交聯(lián)時(shí)間10min。此時(shí)乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的活力回收率分別為32.05％和82.52％。 采用溶膠-凝膠法制備多孔玻璃載體

4、，先用HCl調(diào)節(jié)溶膠溶液的pH至3，然后在60℃下脫水，即可制得透明的凝膠。此法工藝簡(jiǎn)單，所制得的多孔玻璃大小較為均勻。以所制多孔玻璃為載體，采用共價(jià)結(jié)合法共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶。以酶活回收率為指標(biāo)，確定了最佳的固定化條件：載體在甲苯和3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中110℃回流3h進(jìn)行烷基化，再在體積分?jǐn)?shù)O.5％的戊二醛中活化。固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的活力回收率分別為20.13％和13.93％。 研究了兩種共固定化

5、乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶用于乳果糖制備的部分酶學(xué)性質(zhì)。以明膠為載體的共固定化酶的最適溫度為45℃，最適pH為7.5，重復(fù)使用6次后，酶活仍保持在初始活力的80％以上。此法制備條件溫和，所得共固定化酶活力回收率較高。以多孔玻璃為載體的共固定化酶的最適溫度為45℃，最適pH為7.5，熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性良好，重復(fù)操作10次后，酶活仍保持初始活力的70％以上。所以，多孔玻璃法制備的共固定化酶盡管活力回收率較低，但穩(wěn)定性較好，機(jī)械強(qiáng)度高，可以重復(fù)多