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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
研究不同濃度的異甘草素對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞放療敏感性的影響及作用機(jī)制,為異甘草素作為放療增敏劑治療人腦膠質(zhì)瘤提供依據(jù)。
方法:
1.使用超低吸附懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板6孔板,通過無血清條件培養(yǎng)法從SHG44人腦膠質(zhì)瘤貼壁細(xì)胞中提取和純化膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,通過CD133、Nestin聯(lián)合鑒定懸浮細(xì)胞球的干細(xì)胞特性,通過Bcl-2鑒定懸浮細(xì)胞球的膠質(zhì)瘤細(xì)胞源性;
2.運(yùn)用CCK-8試劑盒檢測(cè)不同濃度異甘草素和不
2、同劑量X射線的單獨(dú)和聯(lián)合運(yùn)用下膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖活性,并在顯微鏡下觀察和記錄膠質(zhì)瘤干細(xì)胞懸浮球的成球情況。通過細(xì)胞活性和干細(xì)胞懸浮球在形態(tài)上的抑制情況評(píng)估異甘草素的放療增敏效果;
3.運(yùn)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)不同濃度異甘草素作用下Notch1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,以Notch1信號(hào)通路特異性阻斷劑DAPT作為陽(yáng)性對(duì)照。檢測(cè)異甘草素預(yù)處理后膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)不同劑量X射線照射后NF-κB和凋亡關(guān)鍵蛋白cas
3、pase-3的表達(dá)情況,以此探討異甘草素對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞X射線放療增敏的作用機(jī)制。
結(jié)果:
1.無血清條件培養(yǎng)能夠有效地提取和純化人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞懸浮球,免疫熒光染色CD133和Nestin表達(dá)陽(yáng)性說明懸浮細(xì)胞球具有干細(xì)胞特性,Bcl-2表達(dá)陽(yáng)性說明懸浮細(xì)胞球的腫瘤源性;
2.72h后,膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的活性被異甘草素所抑(P<0.05)。異甘草素處理9天后,膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的成球能力被抑制,20?M濃度以上的異甘草
4、素能夠明顯降低膠質(zhì)瘤干細(xì)胞成球的數(shù)目和干細(xì)胞球的直徑(P<0.01)。在72h內(nèi),膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的細(xì)胞活性并不隨X射線的照射劑量的增加而有所改變。在9天的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞成球過程中,雖然X射線能夠一定程度上減小所形成的懸浮細(xì)胞球的直徑(P<0.01),但是,成球的數(shù)目并沒有因?yàn)閄射線的照射而下降,表現(xiàn)出X射線的耐受;
3.本研究發(fā)現(xiàn)10?M的異甘草素雖然直接抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)的作用有限,但在8Gy較高劑量X射存在的情況下,能夠增加
5、膠質(zhì)瘤放療的敏感性(P<0.05),表現(xiàn)為所形成的干細(xì)胞球數(shù)目下降和直徑下降。20?M的異甘草素殺傷膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的作用明顯,且在4Gy的X射線照射時(shí)就有較強(qiáng)的增敏效果,在8Gy的X射線下聯(lián)合殺傷膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的能力進(jìn)一步提高(P<0.05)。而40?M以上的異甘草素抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖的作用較為明顯,在聯(lián)合X射線干預(yù)下,主要表現(xiàn)出直接抑制增殖的作用;
4.Notch1(Notch1信號(hào)通路受體)、RBPJK(Notch1信號(hào)通路
6、的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子)和Hes1(Notch1信號(hào)通路的靶基因)的表達(dá)在異甘草素組和DAPT組比對(duì)照組顯著下降(P<0.05),呈一定的劑量依賴效應(yīng)。沒有X射線干預(yù)的情況下,異甘草素組和對(duì)照組的P-NF-κB表達(dá)量均較低。4Gy的X射線照射后,異甘草素組P-NF-κB比對(duì)照組高(P<0.05),且X射線照射后6h出就開始表達(dá)增高,24h進(jìn)一步升高(P<0.05)。沒有X射線干預(yù)的情況下,異甘草素組的cleaved caspase-3表達(dá)比對(duì)照
7、組高(P<0.05),隨著時(shí)間推移沒有明顯變化。在4Gy的X射線照射后,未加異甘草素組的cleaved caspase-3表達(dá)比未放射的對(duì)照組明顯增高(P<0.05),但隨著時(shí)間的推移未見明顯變化。而4Gy的X射線照射后,異甘草素預(yù)處理組在6h內(nèi)與未放射組相比,cleaved caspase-3表達(dá)沒有明顯改變,而24h后,cleaved caspase-3表達(dá)開始升高(P<0.05)。
結(jié)論:
1.人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞
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