白細胞介素24抑制膠質(zhì)瘤細胞生長及對放療敏感性影響的實驗研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤的治療仍是目前神經(jīng)外科學(xué)界的難題之一。盡管近些年來在手術(shù)、放療、化療等方面不斷取得進步,然而幾十年來膠質(zhì)瘤的平均生存期并沒有明顯改觀。分子生物學(xué)、遺傳學(xué)的進步促進了惡性膠質(zhì)瘤基因治療的發(fā)展。在眾多的在研基因中白細胞介素24(interleukin-24,IL-24)越來越受到廣泛關(guān)注,IL-24屬于白介素10細胞因子家族,因最初被發(fā)現(xiàn)在終末分化的人類黑色素瘤中高度表達,也被稱為黑色素瘤分化相關(guān)因子-7(mda-7)基因。

2、　　 研究證實IL-24對肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等多種癌細胞均有選擇性的抑制作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn),將IL-24基因轉(zhuǎn)染人非小細胞肺癌的細胞后,腫瘤細胞對放射治療的敏感性得到明顯增強；將IL-24基因轉(zhuǎn)染入人乳腺癌細胞,可明顯增強腫瘤細胞放、化療的治療作用。
　　 在本研究中我們用新型重組腺病毒作載體攜帶IL-24基因(Ad5F35-IL24),分別轉(zhuǎn)染體外的人膠質(zhì)瘤細胞系U251和在體的人膠質(zhì)瘤組織,觀察IL

3、-24基因?qū)δz質(zhì)瘤細胞的影響以及IL-24與放射治療聯(lián)合應(yīng)用是否相互協(xié)同增效,并探討其可能的作用機制。
　　 第一部分
　　 目的:觀察IL-24基因?qū)β闶笤隗w人膠質(zhì)瘤的生長是否存在抑制作用,并初步探討其作用機制。
　　 方法:建立人膠質(zhì)瘤U251的動物模型,瘤內(nèi)注射Ad5F35-IL24,觀察腫瘤的生長情況。通過Western Blot方法檢測腫瘤組織中IL-24蛋白、促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表

4、達情況；通過原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)檢測腫瘤組織的凋亡情況；通過免疫組織化學(xué)染色檢測腫瘤組織的血管密度,以及bFGF、VEGF的表達情況。
　　 結(jié)果:Ad5F35-IL24轉(zhuǎn)染U251膠質(zhì)瘤后IL-24蛋白高度表達,統(tǒng)計學(xué)分析顯示實驗組腫瘤組織和對照組相比較:腫瘤的生長受到明顯抑制(P<0.05)；其凋亡率明顯升高(P<0.05)；Bax/Bcl-2明顯升高(P<0.01)；微血管生成明顯減少(P<0.05)；VEGF和bFGF表

5、達亦明顯減少(P<0.05)。
　　 結(jié)論:IL-24具有抑制膠質(zhì)瘤生長的作用,誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞凋亡和抑制膠質(zhì)瘤微血管生成可能是其主要的作用機制。進一步的研究表明促凋亡蛋白Bax的上調(diào)和抗凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)可能是IL-24誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞凋亡的作用機制；誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤組織中VEGF和bFGF表達的減少可能是IL-24抑制膠質(zhì)瘤微血管生成的作用機制。
　　 第二部分
　　 目的:探討放射性粒子125I在動物體內(nèi)抗人膠

6、質(zhì)瘤的效果及其作用機制。
　　 方法:建立人膠質(zhì)瘤U251的動物模型,瘤內(nèi)植入放射性粒子125I,觀察腫瘤生長情況,在電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)的變化,采用原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)檢測腫瘤組織的凋亡情況,流式細胞儀檢測Bax、Bcl-2的表達,并應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測血管密度和VEGF、bFGF的表達。
　　 結(jié)果:人膠質(zhì)瘤細胞U251的動物模型成功完成,植入放射性粒子125I后,膠質(zhì)瘤生長較對照組明顯受到抑制,電鏡下可呈現(xiàn)核碎

7、裂,核染質(zhì)邊聚等細胞凋亡的形態(tài)特征,檢測顯示實驗組腫瘤組織的Bax/Bcl-2(1.88±0.47)明顯高于對照組(1.11±0.52),P<0.01；實驗組腫瘤組織凋亡率的IHS評分(3.64±0.89)明顯高于對照組(0.81±0.45),P<0.01；實驗組腫瘤組織的微血管密度IHS評分(1.40±0.55)明顯低于對照組(3.23±0.87),P<0.01；實驗組腫瘤組織VEGF的IHS評分(1.58±0.55)明顯低于對照組(

8、4.19±0.45),P<0.01；實驗組腫瘤組織bFGF的IHS評分(2.44±0.89)低于對照組(3.52±0.79),P<0.05。
　　 結(jié)論:放射性粒子125I對在體人膠質(zhì)瘤U251有明確的抑制作用,促進瘤細胞凋亡和降低瘤組織微血管密度是其主要作用機制。
　　 第三部分
　　 目的:分別觀察體外IL-24與X射線,體內(nèi)IL-24與放射性粒子125I聯(lián)合應(yīng)用是否可協(xié)同抑制膠質(zhì)瘤生長,并探討其可能的作用機

9、制。
　　 方法:用Ad5F35-IL24和X射線分別或聯(lián)合干預(yù)體外的U251細胞系,通過MTT法檢測各組的抑制率,通過Hochest33258法檢測各組的凋亡率,通過流式細胞儀檢測各組的Bcl-2和Bax蛋白的表達情況,通過WesternBlot分析各組U251細胞的IL-24、PKR、p-PKR、p38-MAPK、p-p38-MAPK、Bcl-2、Bax蛋白表達水平；用Ad5F35-IL24與放射性粒子125I分別或聯(lián)合干預(yù)

10、在體的膠質(zhì)瘤組織,通過TUNEL法測定各組腫瘤組織的凋亡情況,通過流式細胞儀檢測各組腫瘤組織的Bcl-2和Bax蛋白的表達情況,通過免疫組織化學(xué)染色檢測各組腫瘤組織的血管密度,以及各組腫瘤組織bFGF、VEGF的表達情況。
　　 結(jié)果:體外實驗發(fā)現(xiàn)聯(lián)合干預(yù)組U251細胞的抑制率和凋亡率均明顯增高(P<0.001),Bax/Bcl-2升高(P<0.05),PKR、p38MAPK蛋白的表達和活化都明顯增高(P<0.001)；體內(nèi)實驗

11、結(jié)果同樣證實同其余各組相比:聯(lián)合干預(yù)組腫瘤組織的凋亡率明顯增高(P<0.001),Bax/Bcl-2明顯升高(P<0.05),PKR、p38MAPK蛋白的表達和活化都明顯增高(P<0.001)。同時還發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合干預(yù)組的微血管生成較其余組明顯減少(P<0.05),VEGF和bFGF的表達也明顯減少(P<0.05)。
　　 結(jié)論:無論在體內(nèi)外,IL-24和放射治療對U251膠質(zhì)瘤細胞均具有協(xié)同殺傷作用,推測其機制可能是通過使Bax