金黃色葡萄球菌超抗原樣蛋白Set11的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是一種常見(jiàn)的病原菌，可感染人類并導(dǎo)致一系列的感染和疾病，包括筋膜炎、肺炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、骨髓炎和中毒性休克綜合癥等。為了破壞宿主的天然免疫系統(tǒng)，金黃色葡萄球菌分泌大量的毒力因子抑制或阻止中性粒細(xì)胞的招募和激活來(lái)發(fā)揮其功能。金黃色葡萄球菌NCTC8325菌株能夠分泌14種超抗原樣蛋白(staphylococcalsuperantigen-like(SSLs) proteins)，這些SSLs蛋白最初被命名為金黃色葡萄球菌

2、外毒素樣蛋白(staphylococcal exotoxin-likeproteins(Sets) proteins)，由于其序列和結(jié)構(gòu)與超抗原蛋白高度相似，之后被重新命名為超抗原樣蛋白。SSLs/Sets蛋白家族在不同的金黃色葡萄球菌菌株中的數(shù)量和命名存在差異。如在NCTC8325菌株中已經(jīng)鑒定出14種SSLs蛋白，而在Mu50菌株中目前只發(fā)現(xiàn)了12種超抗原樣蛋白，且以Set命名為主。在已有的研究中，SSLs識(shí)別宿主不同的蛋白來(lái)發(fā)揮多

3、種功能。例如，SSL7結(jié)合補(bǔ)體C5抑制補(bǔ)體系統(tǒng)。SSL10與IgG1相互作用破壞IgG1介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬作用。SSL11通過(guò)阻斷PSGL-1與P-選擇素的相互作用來(lái)抑制中性粒細(xì)胞的遷移。SSL3和SSI4抑制Toll-樣受體2在樹突細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面的表達(dá)。此外，SSL10不僅結(jié)合IgG1，而且與凝血素和Factor Xa相互作用來(lái)抑制凝血系統(tǒng)。多數(shù)超抗原樣蛋白識(shí)別的宿主因子仍未知，超抗原樣蛋白在致病菌感染宿主中的作用機(jī)制也知之甚少。S

4、et11是Mu50菌株分泌的超抗原樣蛋白中的一種，其結(jié)構(gòu)和功能尚不明確。
　　在本論文的第一篇中，為鑒定Set11在宿主的血液/血清中潛在的相互作用蛋白并探索其發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)與分子機(jī)制，我們體外重組表達(dá)并純化了Set11蛋白，首先對(duì)其進(jìn)行了晶體的篩選及大量的晶體優(yōu)化工作。遺憾的是，我們最終沒(méi)有獲得可以用于收集衍射數(shù)據(jù)的晶體，所能得到的晶體衍射分辨率最高為3.6埃。通過(guò)對(duì)Set11進(jìn)行生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)Mu50菌株中的Se

5、t11與NCTC8325菌株中的SSL7有90％的序列同源性，暗示Set11是SSL7在Mu50中的同源蛋白。在此前的報(bào)道中，SSL7已經(jīng)能夠與補(bǔ)體C5結(jié)合進(jìn)而抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的激活。為了探究Set11是否也能夠與C5結(jié)合，我們分別在已有SSL7(PDB ID:1V1O)和SSL7-C5(PDB ID:3KLS)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上構(gòu)建了Set11和Set11-C5復(fù)合物的同源結(jié)構(gòu)模型。結(jié)構(gòu)分析和序列比對(duì)顯示SSL7中參與C5相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘

6、基在Set11中是高度保守的，暗示了C5是Set11的潛在的靶蛋白。為鑒定Set11與C5的相互作用以及新的Set11結(jié)合蛋白，我們以Set11為誘餌，通過(guò)CNBr-Pull down耦聯(lián)質(zhì)譜分析的實(shí)驗(yàn)方法從新鮮的人血/血清中鑒定了Set11的結(jié)合蛋白。它們分別是纖連蛋白1亞型3前蛋白原、補(bǔ)體C5、補(bǔ)體C3前體、血清白蛋白和α-1-微球蛋白前體。我們的結(jié)果肯定了Set11與C5的結(jié)合，并鑒定了Set11潛在的相互作用蛋白，為進(jìn)一步探索S

7、et11的功能提供了線索。
　　E3泛素連接酶TRAIP蛋白是腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白(tumor necrosisfactor(TNF) receptor-associated factors interacting protein)的簡(jiǎn)寫。TRAIP蛋白與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)以及兩個(gè)腫瘤抑制因子CYLD和SYK均存在相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，TRAIP與TRAF2相互作用抑制TRAF2介導(dǎo)的NF-κB的激活，與SYK

8、和CYLD的相互作用，則負(fù)調(diào)TNF介導(dǎo)的NF-κ3的激活，從而抑制細(xì)胞的凋亡。而近幾年研究表明，TRAIP作為一種RING type E3泛素連接酶，通過(guò)RING domain與E2泛素結(jié)合酶UBE2U相互作用，在蛋白質(zhì)泛素化過(guò)程中也發(fā)揮著重要功能，但是泛素化的底物和分子機(jī)制目前仍未知。
　　在本論文的第二篇中，我們通過(guò)體外重組、表達(dá)并純化了小鼠、斑馬魚、非洲爪蟾和果蠅中E3泛素連接酶TRAIP蛋白R(shí)ING Domain結(jié)構(gòu)域，并