金黃色葡萄球菌TRAP蛋白及VraX蛋白的生物學(xué)功能研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，金葡菌)是一種常見的革蘭氏陽性致病菌，廣泛分布于自然界中，通過飛沫、接觸等途徑傳播并引起多種疾病。當(dāng)金葡菌侵入機(jī)體時(shí)，機(jī)體會(huì)通過補(bǔ)體系統(tǒng)、吞噬細(xì)胞、不飽和脂肪酸等多種防御系統(tǒng)清除入侵細(xì)菌。同時(shí)金葡菌自身在感染機(jī)體的過程中，也會(huì)表達(dá)多種分子對(duì)抗機(jī)體的清除作用。近年來由于抗生素濫用，導(dǎo)致了多種耐藥性金葡菌的出現(xiàn)，耐藥金葡菌引發(fā)的感染是臨床面臨的棘手難題。
　　本論文主要針對(duì)以

2、下兩個(gè)內(nèi)容展開了相關(guān)的研究，具體如下:①TRAP蛋白參與長鏈不飽和脂肪酸殺傷金葡菌的機(jī)制研究;②假定蛋白VraX參與金葡菌天然耐藥的機(jī)制研究。
　　本研究的第一部分為TRAP蛋白參與長鏈不飽和脂肪酸殺傷金黃色葡萄球菌的機(jī)制研究。長鏈不飽和脂肪酸一般指≥C16，含有一個(gè)以上雙鍵的脂肪酸。相關(guān)研究表明，該類脂肪酸是天然免疫系統(tǒng)中重要的組成成分，具有抗金葡菌感染的能力。TRAP是金葡菌致病性相關(guān)的蛋白分子，目前關(guān)于它的生物學(xué)功能存在爭議

3、，其確切功能尚不清楚。該部分內(nèi)容具體如下:
　　1.△trap對(duì)亞油酸的敏感性檢測:我們實(shí)驗(yàn)室前期通過基因同源重組的方法獲得了traP基因的缺失突變株(△traP)，當(dāng)其與亞油酸進(jìn)行共孵育培養(yǎng)時(shí)，與野生型菌株相比，其存活率明顯降低。通過基因芯片對(duì)比分析我們發(fā)現(xiàn)在△traP中與脂代謝相關(guān)聯(lián)的基因fadD的mRNA水平明顯降低。
　　2.△fadD對(duì)亞油酸的敏感性檢測:我們通過基因同源重組的方法獲得了fadD基因缺失突變株（△f

4、adD）。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，△fadD對(duì)亞油酸敏感性也明顯增強(qiáng)。我們?cè)凇鱰raP中回復(fù)fadD的水平，但其對(duì)亞油酸的敏感性未得到回復(fù)。
　　3.TRAP蛋白通過與FadD蛋白相互作用參與亞油酸殺傷金葡菌的過程:通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)及質(zhì)譜鑒定的方法，我們發(fā)現(xiàn)FadB和FadD可能是TRAP的結(jié)合蛋白。進(jìn)一步的ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明只有FadD蛋白能夠特異與TRAP蛋白結(jié)合。這表明TRAP蛋白通過與FadD蛋白相互作是其影響亞油酸對(duì)

5、金葡菌殺傷的主要機(jī)制。
　　本論文的第二部分為假定蛋白VraX參與金黃色葡萄球菌天然耐藥的機(jī)制研究。天然耐藥是指在抗生素作用下，抗生素敏感細(xì)菌中的一部分可以存活和繁殖，成為接收外來耐藥基因的載體。研究表明抗生素作用下，金葡菌中的多種分子異常表達(dá)對(duì)抗藥物的殺傷作用。通過文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，多種抗生素處理后金葡菌假定蛋白VraX的水平明顯升高（＞20倍）。本部分研究中，我們主要探索VraX參與金葡菌天然耐藥的機(jī)制研究，具體內(nèi)容如下:

6、　　1.VraX蛋白與金葡菌的天然耐藥明顯相關(guān):我們通過基因同源重組的方法獲得了vraX基因的缺失突變株(△vraX)。藥物敏感性檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明△vraX對(duì)多種抗生素敏感。
　　2.RNaseⅢ調(diào)控金葡菌中vraX的水平:我們通過RNA-pulldown實(shí)驗(yàn)中證實(shí)RNaseⅢ能夠結(jié)合vraX，基因芯片對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)△RNaseⅢ中vraX的水平明顯升高，我們利用RT-PCR及qRT-PCR驗(yàn)證這一結(jié)果。進(jìn)一步的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)證實(shí)RN

7、aseⅢ可以特異的結(jié)合vraX。同時(shí)降解實(shí)驗(yàn)表明，在Mg2+存在的條件下vraX可以被RNaseⅢ特異的降解。我們的結(jié)果提示RNaseⅢ能夠結(jié)合并降解vraX。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)金葡菌中的TRAP蛋白可以通過與FadD蛋白相互作用參與亞油酸對(duì)金葡菌的殺傷。同時(shí)，我們的研究結(jié)果表明VraX蛋白可能參與了金葡菌的天然耐藥，并且RNaseⅢ可以影響其水平。以上研究將為抗金葡菌感染研究提供可能的藥物靶點(diǎn)以及新的理論基礎(chǔ)。