鈣激活氯通道 TMEM16A-ANO1 在肝癌中低表達(dá)的可能機(jī)制及其對細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)擬1、研究肝癌組織、癌旁組織和良性肝組織中TM EM16 A蛋白水平的表達(dá)差異，在肝癌組織和癌旁組織中研究TMEM16AmRN A水平表達(dá)差異；2、在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中轉(zhuǎn)入TMEM16 A過表達(dá)質(zhì)粒并研究TM EM16 A過表達(dá)對肝臟腫瘤細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和凋亡能力的影響。3、研究肝癌組織和癌旁組織的TMEM16A基因啟動子CpG島甲基化程度并在SMMC-7721中研究去甲基化藥物5-氮雜-2脫氧胞苷處理對

2、TMEM16A蛋白表達(dá)水平和TMEM16AmRNA表達(dá)水平的影響。
　　方法：1、本課題收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科40例肝癌切除術(shù)患者的肝癌組織及其癌旁組織40對和6例肝良性病變，利用western blot方法研究TMEM16A蛋白在肝癌組織、癌旁組織和肝臟良性組織中的表達(dá)水平，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究TMEM16AmRNA在肝癌組織和癌旁組織中表達(dá)水平；2、通過在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中轉(zhuǎn)入TMEM16A過表達(dá)

3、質(zhì)粒pEGFP-TMEM16A和pcDNA3.1-TMEM16A和相應(yīng)對照空載pEGFP-N1和pcDNA3.1，使用MTT比色法、劃痕實(shí)驗(yàn)法和A nne xin V& P I雙染凋亡檢測法，研究TM EM16A過表達(dá)質(zhì)粒對肝腫瘤細(xì)胞SMMC-7721增殖能力、遷移能力及細(xì)胞凋亡的影響；3、用亞硫酸氫鹽克隆測序法（Bis ul fite Sequence PCR，BSP）檢測肝癌組織和癌旁組織TMEM16A基因啟動子CpG島甲基化程度差

4、異，并使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2脫氧胞苷處理SMMC-7721細(xì)胞，并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測處理造成的TMEM16AmRNA變化差異，用wes tern blot檢測處理造成的TMEM16A蛋白變化差異以及用亞硫酸氫鹽克隆測序法檢測TMEM16A基因啟動子CpG島甲基化程度差異。
　　結(jié)果：本研究第一次證實(shí)：1、通過western blot結(jié)果顯示肝癌中TMEM16A蛋白表達(dá)水平相比于癌旁組織（P＜0.01）和良性肝組織

5、（P＜0.001）明顯低表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示肝癌中TMEM16AmRNA表達(dá)水平相比于癌旁組織明顯低表達(dá)（P＜0.001）；2、通過在肝癌細(xì)胞系 SMMC-7721中轉(zhuǎn)入過表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-TM E M16A和相應(yīng)空載pEGFP-N1，并利用熒光顯微鏡拍照和異常細(xì)胞分析顯示TMEM16A在肝癌細(xì)胞中的過表達(dá)明顯提高了異常細(xì)胞百分比（P＜0.001）；3、通過在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中轉(zhuǎn)入TMEM16A的過表達(dá)質(zhì)粒并

6、通過MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和 Annexin V& PI雙染凋亡檢測可以發(fā)現(xiàn)，TMEM16A的過表達(dá)明顯抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖能力（P＜0.001），并促進(jìn)細(xì)胞凋亡（P＜0.05），但是對腫瘤細(xì)胞的遷移能力并無明顯影響。4、亞硫酸氫鹽克隆測序?qū)嶒?yàn)結(jié)果證實(shí)相比于癌旁組織TMEM16A基因啟動子CpG島甲基化水平在肝癌組織中處于更高水平（P＜0.05）。并且，相比于對照組的腫瘤細(xì)胞經(jīng)過去甲基化5-氮雜-2脫氧胞苷處理的SMMC-7721