PDi-GPⅡb-Ⅲa受體參與糖尿病血小板活化的基礎研究.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病(diabctes mellitus，DM)和心血管疾病是全球目前最主要的疾病負擔和死亡原因，國際糖尿病聯(lián)盟(International Diabetes Federation，IDF)在2013年推測全球糖尿病在20-79歲成人中的患病率為8.3％，估計到2035年全球將有近5.92億人患糖尿病。中國大陸地區(qū)有1億人患糖尿病，中國已成為世界上糖尿病患者最多的國家。動脈粥樣硬化是糖尿病患者的主要死亡原因，糖尿

2、病患者的心臟病疾病相關的死亡率是非糖尿病患者的2～4倍，而絕大多數(shù)急性心血管事件都與血栓形成有關，在該過程中血小板的激活是啟動因素，其激活途徑具有多樣性，其中GPⅡb/Ⅲa受體激活是血小板活化聚集的最終共同途徑，與血小板聚集、血栓形成密切相關。糖尿病狀態(tài)下血栓形成機制尚未完全闡明，其中血小板活化和血管內皮細胞損傷可能起著關鍵作用。
　　抗血小板治療能顯著降低糖尿病患者的心腦血管事件發(fā)生率，然而即使在雙重抗血小板治療下，糖尿病患者的

3、血小板聚集和活化仍然增加，因此尋找最佳抗血小板治療方案對于降低糖尿病患者的心血管疾病風險，降低死亡率具有重要意義。近期的研究結果強調了蛋白質二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase，PDI)、微粒（microparticle，MP）在血小板活化過程中的作用。PDI可以通過調控血小板表面GPⅡb/Ⅲa受體二硫鍵的異構，促使GPⅡb/Ⅲa受體空間結構改變，活化GPⅡb/Ⅲa受體，進而活化血小板，促進血栓形成。糖尿

4、病狀態(tài)下，血管內皮細胞受損，釋放更多的內皮細胞源的微粒(endothelial derived microparticles，EMP)，血小板活化增多，而且血小板也釋放更多血小板源微粒(platelet derived microparticles，PMP)，其上攜帶PDI。
　　我們推測糖尿病狀態(tài)下，內皮細胞受損，釋放出EMP，其上攜帶PDI，EMP-PDI通過與血小板表面的GPⅡb/Ⅲa受體結合，活化血小板，釋放更多的攜帶PD

5、I的PMP，從而實現(xiàn)了血小板級聯(lián)放大信號的傳導;同時血小板源性PDI削弱了胰島素的抗血小板活化的作用。因此，糖尿病患者血小板的粘附聚集能力顯著增加，容易形成血栓。
　　研究目的：
　　(1)研究糖尿病狀態(tài)下血漿中血小板活性和PDI含量的變化;
　　(2)研究糖尿病狀態(tài)下血漿中凝血狀態(tài)的變化;
　　(3)探討糖尿病導致的內皮細胞受損EMP、EMP-PDI釋放量的變化;
　　(4)從整體水平探討糖尿病狀態(tài)下EM

6、P-PDI在血小板活化過程中的作用。
　　研究方法及材料：
　　(1)動物模型建立
　　4周齡雄性ApoE-/-小鼠60只，行腹腔注射糖耐量試驗(intraperitoneal glucosetolerance test，IPGTT)后隨機分為普通飲食組（30只）和高糖高脂飲食組（30只），分別給予普通飲食和高糖高脂飲食，6周后再次測各組小鼠的IPGTT。出現(xiàn)胰島素抵抗的高糖高脂飲食組的小鼠腹腔注射注射鏈脲佐菌素(st

7、reptozocin，STZ)85mg/kg-90mg/kg，2周后隨機血糖≥11.1 mmol/L時，可作為ApoE-/-小鼠2型糖尿病成模的動物入組。再將小鼠分為普食組，普食+蘆丁組，糖尿病組，糖尿病十蘆丁組各15只小鼠，普食組和糖尿病組小鼠每日予生理鹽水灌胃一次，劑量為0.1ml/10g;普食+蘆丁組，糖尿病十蘆丁組小鼠每日予蘆丁灌胃一次，劑量為80mg/kg，灌胃8周后取小鼠的血液用于實驗。
　　(2)小鼠體重的監(jiān)測:每周

8、定期監(jiān)測小鼠的體重。
　　(3)血漿的獲得
　　取小鼠心尖血于0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝的EP管中。常溫下，3000rpm/min離心后獲得乏血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP)，用于后面的實驗。
　　(4)血小板的提取
　　常溫下，取小鼠心尖血于0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝的EP管中，經(jīng)過800rpm/min離心10分鐘后獲得富含血小板血漿(platelet-rich p

9、lasma，PRP)，后者經(jīng)800g/min離心，離心10分鐘后獲得血小板沉淀。血小板沉淀經(jīng)改良臺式液洗滌、重懸。血小板懸液的濃度經(jīng)細胞計數(shù)儀調整為1×106/ml，用于后面的實驗。
　　(5)流式細胞術檢測小鼠血小板活化指標
　　流式測血小板表面P-selectin(CD62P)、GPⅡb/Ⅲa及血小板白細胞聚集體(platelet-leukocyte-aggregetes，PLA)的表達:在BD流式管中加入適量待測樣品及

10、待檢測指標相應的熒光抗體，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)補齊至100μL，室溫避光孵育15-30min，然后加200μL4％多聚甲醛混勻固定后上機檢測。
　　(6)酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)
　　小鼠血漿中PDI、可溶性P-選擇素(soluble P-selectin，sP-sel)、血管性血友病因子(von Wi

11、llebrand factor，vWF)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)ib)的含量。所有的操作方法及步驟嚴格按照說明書的要求進行。
　　(7)原位-鄰位鏈接技術（proximity ligation assay，PLA）證實EMP-PDI可以與血小板上的GPⅡb/Ⅲa結合
　　原位-鄰位鏈接技術是一種新的生物檢測技術，可用于檢測兩種蛋白質間的相互作用，當兩種蛋白發(fā)生反應時，兩種蛋白上的熒光探針也可以相互結合，從而可檢

12、測到紅色的免疫熒光，如果兩種蛋白沒有發(fā)生相互作用，則檢測不到紅光。分離得到血小板和EMP后按照實驗步驟進行，經(jīng)過抗體孵育、PLA探針孵育、鏈接、擴增、封片后在熒光顯微鏡下進行觀察。
　　結果：
　　(1)ApoE-/-小鼠糖耐量試驗結果
　　IPGTT結果顯示:4周時普通飲食組小鼠與糖尿病組小鼠的IPGTT結果的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);小鼠分別經(jīng)普通飲食和高糖高脂飲食喂養(yǎng)6周后，普通飲食組小鼠經(jīng)普通飲食喂養(yǎng)前

13、后IPGTT結果差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;糖尿病組小鼠經(jīng)高糖高脂喂養(yǎng)前后IPGTT結果差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，同時10周齡時糖尿病組小鼠糖耐量結果較普通飲食組小鼠顯著升高（P＜0.05）。
　　(2)ApoE-/-小鼠體重變化情況
　　4周齡時，各組ApoE-/-小鼠體重差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05);高糖高脂飲食喂養(yǎng)4周后，與普通飲食組小鼠相比，糖尿病組ApoE-/-小鼠體重增加，差異具有統(tǒng)計學意義

14、(P＜0.05);注射STZ2周后，糖尿病組小鼠與普通飲食組小鼠體重差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);繼續(xù)分別經(jīng)高糖高脂飲食和普通飲食喂養(yǎng)至20周齡時，糖尿病組小鼠體重明顯大于普通飲食組（P＜0.05）。
　　(3)ApoE-/-小鼠血生化結果
　　與糖尿病組小鼠相比，普食組、普食+蘆丁組、糖尿病+蘆丁組小鼠總膽固醇(totalcholesterol，TC)，甘油三酯(triglyceride，TG)低密度脂蛋白膽固醇(lo

15、w densitylipoprotein cholesterol，LDL-C)水平均明顯降低(P＜0.05～0.001)。四組小鼠血漿中高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）的含量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　(4)各組小鼠血漿中Fib含量無顯著差異，糖尿病組小鼠血漿vWF含量增加
　　ELISA檢測小鼠血漿中Fib的含量，結果顯示四組小鼠間Fib

16、的含量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。ELISA檢測小鼠血漿中vWF的含量，結果顯示糖尿病組小鼠vWF的含量較普食組、普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組血漿中vWF的含量均升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05～0.01），普食組，普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組間vWF的含量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。
　　(5)糖尿病小鼠血小板活化增加
　　流式細胞術檢測小鼠血小板活化水平，糖尿病組小鼠血小板表面的GPⅡb/Ⅲa、P-se

17、lectin的表達量升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05～0.001)，普食+蘆丁組的GPⅡb/Ⅲa表達量低于普食組的表達量，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，糖尿病+蘆丁組的GPⅡb/Ⅲa、P-selectin表達量低于糖尿病組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01～0.001)。測血小板白細胞聚集體(PLA)的結果顯示糖尿病組小鼠的血小板單核細胞聚集體(platelet-monocyte aggregates，PMA)、血小板中性粒

18、細胞聚集體(platelet-neutrophil aggregates，PNA)的表達量均高于普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組小鼠的表達量，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05～0.001)，普食+蘆丁組小鼠的表達量的PMA、PNA的表達量均低于普食組小鼠的表達量，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05～0.01)。
　　(6)糖尿病小鼠血漿中sP-sel含量增加
　　ELISA檢測小鼠血漿中sP-sel的含量，結果顯示糖尿病組小鼠sP

19、-sel的含量較普食組，普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組小鼠sP-sel的含量升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05～0.001);普食組，普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組間小鼠sP-sel的含量差異無統(tǒng)計學意義。
　　(7)糖尿病組小鼠血漿中CD144+的EMP含量增加，EMP上攜帶有PDI，糖尿病組EMP-PDI的含量增加。
　　流式細胞術檢測小鼠血漿中CD144+EMP的含量，結果顯示糖尿病組小鼠CD144+的EMP的含量較普

20、食組，普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組的含量升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，普食組，普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組間含量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。以CD144-APC和PDI-FITC雙色流式細胞術證實EMP上攜帶PDI，糖尿病組小鼠EMP-PDI的含量較普食組，普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組含量升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05～0.01)。
　　(8)糖尿病小鼠PDI含量增加
　　ELISA檢測小鼠PDI含

21、量，結果顯示糖尿病組的PDI含量高于普食組，普食+蘆丁組和糖尿病+蘆丁組的含量，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05～0.001)，同時，普食+蘆丁組低于普食組、糖尿病組和糖尿病+蘆丁組的含量，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05～0.001)。
　　(9)內皮細胞來源的微粒的分離及鑒定
　　以CD144標記為內皮細胞來源的微粒，經(jīng)免疫磁珠分選技術及超速離心后，使CD144+的EMP的陽性率由50％左右升高到90％。分離得到的微粒經(jīng)

22、流式細胞儀采用100nm和1000nm標準熒光微球圈出微粒的門。透射電鏡觀察分離得到的微粒，為典型的直徑大于100nm的雙層膜小囊泡。
　　(10)EMP可以活化血小板，RL90及蘆丁抑制EMP介導的PDI依賴的血小板活化
　　我們分別用二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)（10μg/mL）、RL90（1μg/mL）、蘆丁(60μM)預處理EMP，然后分別去刺激C57正常小鼠的血小板，檢測血小板的

23、活化水平。結果顯示四組小來源的微粒在不同的刺激條件下，EMP刺激血小板后的血小板的GPⅡb/Ⅲa、P-selectin的表達量高于對照組、RL90(1μtg/mL)、蘆?。?0μM）預處理的EMP刺激血小板后血小板的GPⅡb/Ⅲa、P-selectin的表達量，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05～0.001)。
　　(11)糖尿病小鼠來源的EMP活化血小板活化增加
　　通過對普食組、普食+蘆丁組，糖尿病組和糖尿病+蘆丁組小鼠來

24、源的EMP在相同刺激條件下的GPⅡb/Ⅲa的表達的比較，發(fā)現(xiàn)ADP孵育EMP刺激組糖尿病組小鼠的GPⅡb/Ⅲa的表達較普食組降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在其他相同刺激條件下，糖尿病組來源的EMP刺激后的血小板GPⅡb/Ⅲa、P-selectin的表達量增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05～0.001)。
　　(12) Duolink原位-鄰位鏈接技術（proximity ligation assay，PLA）證實E

25、MP-PDI可以與血小板上的GPⅡb/Ⅲa結合
　　分離得到血小板和EMP后按照實驗步驟進行，經(jīng)過抗體孵育、PLA探針孵育、鏈接、擴增、封片后在免疫熒光顯微鏡下進行觀察。我們檢測到血小板上的紅光，證實EMP-PDI與血小板上的GPⅡb/Ⅲa發(fā)生結合。
　　結論：
　　(1)糖尿病小鼠血小板表面GPⅡb/Ⅲa、P-selectin表達量顯著增加，血漿PNA增加，血小板活化增加;
　　(2)糖尿病小鼠血漿中血脂增高，