超聲分子成像靶向活化血小板上的糖蛋白Ⅱb-Ⅲa受體評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊.pdf

1、目的:
　　動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊及其并發(fā)癥是危害人類(lèi)健康的“頭號(hào)殺手”。易損斑塊(Vulnerable Plaque)不可預(yù)測(cè)的突然破損或侵蝕、血小板激活和血栓形成造成血管迅速閉塞是引發(fā)心肌梗死、腦血栓等突發(fā)致死性和非致死性心腦血管事件最重要的發(fā)病機(jī)制，其中動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的破裂又被視為最重要的始動(dòng)環(huán)節(jié)。然而，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展是個(gè)隱匿的慢性過(guò)程，大部分心腦血管事件發(fā)作前都沒(méi)有先兆表現(xiàn)。因此，早期識(shí)別動(dòng)脈粥樣硬化易損斑

2、塊，進(jìn)而指導(dǎo)早期的干預(yù)治療，對(duì)于避免或延緩事件的發(fā)生有著十分重要的臨床意義。但是目前臨床尚無(wú)早期識(shí)別和檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的有效手段。隨著靶向分子成像技術(shù)的新興和發(fā)展，現(xiàn)有的許多無(wú)創(chuàng)影像手段，如:超聲、核素(PET)、MRI和CT等均在對(duì)易損斑塊評(píng)價(jià)進(jìn)行積極的分子水平探索。
　　其中，靶向超聲分子成像(Ultrasound Molecular Imaging，UMI)是將靶向病變組織特定分子的特異性配體連接于超聲微泡表面，構(gòu)建

3、成靶向超聲微泡，以其作為分子探針，采用增強(qiáng)對(duì)比超聲(Contrast Enhanced Ultrasound，CEU)的方法對(duì)粘附在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的特異分子進(jìn)行分子水平超聲顯影，從而實(shí)現(xiàn)疾病分子水平上特異性診斷的目的。與其他的傳統(tǒng)影像技術(shù)相比，超聲分子成像技術(shù)具有實(shí)時(shí)、高空間及時(shí)間分辨率、無(wú)放射污染、儀器便攜和價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)。它是在體評(píng)價(jià)血液循環(huán)內(nèi)固定的分子靶點(diǎn)時(shí)空變化和特征的理想方法，特別適合對(duì)斑塊炎癥反應(yīng)和動(dòng)脈血栓形成時(shí)分布在血管內(nèi)皮和

4、活化血小板上的分子靶點(diǎn)進(jìn)行在體定位、定量和可視化。目前，國(guó)際上已有研究者成功實(shí)現(xiàn)了UMI靶向動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)皮細(xì)胞表面上的分子靶點(diǎn)，主要包括:靶向血小板粘附的活化的血管假性血友病因子(von Willebrand Factor, vWF)，靶向炎癥的血管細(xì)胞粘附因子-1（Vascular Cell Adhesion Molecular-1，VCAM-1）和P-選擇素，靶向新生血管的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(Vascular Endot

5、helial Growth FactorReceptor-2，VEGFR-2)和白介素-8;而迄今為止，UMI靶向活化血小板和血栓來(lái)檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化表型的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。然而，易損斑塊內(nèi)皮上的活化血小板和血栓在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展方面扮演著非常重要的角色，并且與動(dòng)脈斑塊的易損性（Vulnerability）密切相關(guān);再者，動(dòng)脈粥樣硬化血栓是無(wú)癥狀的、隱匿的，其可以作為高風(fēng)險(xiǎn)易損斑塊的預(yù)警信號(hào)，并可以通過(guò)UMI靶向活化血小板檢測(cè)到。

6、因此，UMI靶向“斑塊內(nèi)皮上的活化血小板”，無(wú)疑可為臨床檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊并對(duì)其進(jìn)行危險(xiǎn)分層提供非常有價(jià)值的手段，進(jìn)而指導(dǎo)干預(yù)治療，避免或延緩急性心腦血管事件的發(fā)生。
　　血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體(GlycoproteinⅡb/Ⅲa，GPⅡb/Ⅲa)，亦稱(chēng)αⅡbβ3整合素，是高度表達(dá)于活化的血小板表面的主要受體，亦是血小板活化的一種生物標(biāo)志，其可與纖維蛋白原等多種粘附蛋白的RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，Arg-G

7、ly-Asp)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，是動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成過(guò)程中血小板與其它血小板以及毗鄰細(xì)胞之間相互作用的必需條件，更是各種因素致血小板聚集和血栓形成的最終共同通路。有研究報(bào)道，急性冠脈綜合征或不穩(wěn)定型心絞痛患者血液循環(huán)中血小板聚集和循環(huán)血小板表面的GPⅡb/Ⅲa受體的表達(dá)情況明顯高于穩(wěn)定型心絞痛患者或健康志愿者。因此，GPⅡb/Ⅲa受體是顯影動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中聚集血小板的一個(gè)潛在的標(biāo)志，可作為血栓檢測(cè)及臨床抗凝治療中一種重要的靶向分子。然

8、而，晚期動(dòng)脈粥樣硬化病變中血小板上GPⅡb/Ⅲa受體表達(dá)與斑塊嚴(yán)重程度之間的相關(guān)性方面的研究數(shù)據(jù)是很有限的，而且活化血小板表面的GPⅡb/Ⅲa受體是否能夠作為高風(fēng)險(xiǎn)斑塊的生物標(biāo)志是不清楚的，這亦是本研究首要解決的問(wèn)題。
　　含RGD序列的寡肽對(duì)GPⅡb/Ⅲa受體具有較高的粘附性，已有研究將RGD序列線性寡肽連接在超聲微泡表面，通過(guò)靶向微泡與血栓中活化的血小板GPⅡb/Ⅲa受體特異性結(jié)合，成功實(shí)現(xiàn)了深靜脈、心房血栓的靶向超聲分子成像

9、。然而由于動(dòng)脈內(nèi)存在高剪切應(yīng)力和“軸流”特性，實(shí)現(xiàn)動(dòng)脈血栓的靶向分子顯像則需要靶向結(jié)合能力更強(qiáng)的微泡。有研究表明，人工合成的RGD環(huán)寡肽序列能夠模擬人體內(nèi)源性RGD結(jié)合位點(diǎn)，使其在動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)脈較大血流的情況下，比含RGD序列的線性寡肽結(jié)合GPⅡb/Ⅲa受體的能力高30倍。目前，我們課題組已成功構(gòu)建出攜帶環(huán)RGD寡肽的靶向超聲微泡，并通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其對(duì)GPⅡb/Ⅲa受體的粘附能力，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了大動(dòng)脈血栓的分子成像。但是上述實(shí)驗(yàn)

10、研究中所采用的大動(dòng)脈急性血栓模型構(gòu)建方法均未能接近體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊血栓形成的病理機(jī)制，并不能反應(yīng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展及演變過(guò)程。因此，本研究應(yīng)用載脂蛋白E敲除(ApoE-/-)的小鼠建立了一種真正的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的動(dòng)物模型，為研究UMI識(shí)別易損斑塊的研究提供了模型基礎(chǔ)。
　　因此，本研究應(yīng)用C57BL/6野生型和ApoE-/-小鼠建立不同梯度的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型。分別應(yīng)用組織病理學(xué)、掃描和透射電鏡方法、免疫熒光

11、等方法，探討動(dòng)脈斑塊內(nèi)皮上活化血小板表面的整合素GPⅡb/Ⅲa受體是否能夠作為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的一個(gè)生物標(biāo)志及其可能的機(jī)制;并通過(guò)CEU結(jié)合靶向超聲微泡(MB-cRGD)，對(duì)斑塊內(nèi)皮上活化血小板表面的GPⅡb/Ⅲa受體進(jìn)行定量，進(jìn)而識(shí)別易損斑塊，以期為臨床提供一種無(wú)創(chuàng)、有效識(shí)別和評(píng)價(jià)易損斑塊的新方法。
　　方法:
　　1、超聲微泡的制備及理化性質(zhì)鑒定
　　將各種相關(guān)脂質(zhì)材料與人工合成的磷脂環(huán)五肽或分子量相當(dāng)、結(jié)

12、構(gòu)相似的同型非特異性多肽按一定比例加入20 ml蒸餾水中，在75℃水浴條件下使其完全溶解后，通入全氟丙烷氣體(C3F8)，使用高速剪切儀將其剪切至形成乳白色液體制備靶向超聲脂質(zhì)微泡(MB-cRGD)和同型對(duì)照非靶向微泡(MB-CON)，靜置、洗滌、純化3次。制備及純化后的微泡均置于冰箱中4℃保存?zhèn)溆谩ｏ@微鏡觀察微泡形態(tài)，并采用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀檢測(cè)微泡的粒徑大小及濃度。
　　2、小鼠不同梯度動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型的制備及分組
　　應(yīng)

13、用C57BL/6野生型和ApoE-/-小鼠建立不同梯度的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型和對(duì)照模型，6周齡的C57BL/6和ApoE-/-雄性小鼠，分別給予普通飲食或者高膽固醇飲食（hypercholesterolemic diet, HCD，21％脂肪和0.25％膽固醇），持續(xù)喂養(yǎng)30周時(shí)，各組隨機(jī)選取3只小鼠，分離其腹主動(dòng)脈大體標(biāo)本，進(jìn)行油紅O染色大體染色，觀察各組小鼠動(dòng)脈斑塊的情況。動(dòng)物分組為:C57BL/6小鼠普通飲食組(C57BL/6

14、+ chow)、C57BL/6小鼠高膽固醇飼養(yǎng)組(C57BL/6+HCD)、ApoE-/-小鼠普通飲食組(ApoE-/-+ chow)、ApoE-/-小鼠高膽固醇飼養(yǎng)組（ApoE-/-+ HCD）。
　　3、體內(nèi)熒光驗(yàn)證血小板粘附于主動(dòng)脈斑塊內(nèi)皮表面
　　通過(guò)心臟采血法分別取C57BL/6野生型小鼠的全血，0.129M枸櫞酸鈉抗凝后經(jīng)離心法提取濃縮血小板并制備血小板混懸液。制備的血小板混懸液與鈣黃綠素-AM(Calcein-

15、AM，300ng/ml)暗處孵育15min后，經(jīng)尾靜脈留置針隨機(jī)分別注入以上4組(n=6)不同小鼠體內(nèi);另外，分別注入相同體積的不含血小板的鈣黃綠素-AM和不含鈣黃綠素-AM的PBS液體至ApoE-/-+ HCD小鼠體內(nèi)，作為陰性對(duì)照(n=6)和熒光對(duì)照組(n=6)。注入15min后，處死各組小鼠，收集腹主動(dòng)脈，快速冰凍切片，置于普通光學(xué)及熒光顯微鏡下觀察孵育后的血小板在各組小鼠腹主動(dòng)脈斑塊內(nèi)皮表面的粘附情況。
　　結(jié)果:

16、　　1、超聲微泡的特性
　　采用高速剪切法制備的MB-cRGD、MB-CON在顯微鏡下觀察均為透亮微氣泡，大小形態(tài)一致。采用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀測(cè)得MB-cRGD和MB-CON的平均粒徑分別約為2.52±0.28μm和2.54±0.30μn，濃度分別約為(1.13±0.19)×109/ml和(1.12±0.22)×109/ml。兩種微泡的粒徑和濃度并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　2、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型的制備情況
　　四

17、組小鼠的油紅O染色結(jié)果顯示，ApoE-/-+ HCD組小鼠的腹主動(dòng)脈可見(jiàn)較明顯的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，其后是ApoE-/-+ chow組，C57BL/6+HCD組小鼠的腹主動(dòng)脈僅有少量被染成紅色的脂紋形成，C57BL/6+chow組小鼠的腹主動(dòng)脈血管上未見(jiàn)粥樣硬化斑塊形成。
　　結(jié)論:
　　1、動(dòng)脈斑塊內(nèi)皮活化血小板表面的GPⅡb/Ⅲa受體與斑塊的易損性顯著相關(guān)，其可作為易損斑塊的生物標(biāo)志;
　　2、GPⅡb/Ⅲa可通