Akt-Nrf2通路在CBDL大鼠血清誘導(dǎo)的BM-MSCs促血管生成功能增強(qiáng)中的作用研究.pdf

1、背景和目的:
　　肝肺綜合征(Hepatopulmonary syndrome，HPS)是在肝病和/或門靜脈高壓的背景下由肺內(nèi)微血管擴(kuò)張(intra-pulmonary microvascular dilation，IPVD)引起的動(dòng)脈低氧血癥以及年齡相關(guān)的異常肺泡動(dòng)脈氧分壓差。肝肺綜合征在肝硬化患者中的發(fā)生率在5％至32％之間。肝肺綜合征的發(fā)生顯著增加了患者的死亡率，而肝移植被認(rèn)為是唯一有效的治療措施。膽總管結(jié)扎(common

2、bile duct ligation，CBDL)大鼠是目前唯一被廣泛接受的肝肺綜合征動(dòng)物模型。研究發(fā)現(xiàn)肺血管新生在CBDL大鼠肝肺綜合征的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，然而這一過程背后的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)被認(rèn)為是血管生長(zhǎng)的調(diào)控者，因?yàn)樗鼈兙哂修D(zhuǎn)分化成內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)或旁分泌作用的潛力。多年來，MSCs在不同類型疾病中的治

3、療作用已經(jīng)受到廣泛的關(guān)注，特別是在創(chuàng)傷或局部缺血疾病中的治療應(yīng)用。然而，關(guān)于MSCs參與疾病病理性血管新生過程的研究相對(duì)較少。骨髓MSCs(BM-MSCs)的動(dòng)員可以發(fā)生于多種刺激，包括慢性缺氧、炎癥和損傷。在CBDL的早期階段，肝臟和遠(yuǎn)端器官可能被增多的膽紅素、內(nèi)毒素和炎癥介質(zhì)所損傷。同時(shí)，由于缺氧過程伴隨在CBDL的整個(gè)晚期階段，這表明BM-MSCs可能在肝肺綜合征大鼠模型中被動(dòng)員。基質(zhì)衍生因子-1/C-X-C趨化因子受體4(str

4、omal cell-derived factor1/C-X-C chemokine receptor type4,SDF-1/CXCR4)是BM-MSCs中的重要趨化因子/趨化因子受體信號(hào)軸，它們不僅在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)中起關(guān)鍵作用，而且在BM-MSCs的定向遷移中也起到重要作用。結(jié)合以上證據(jù)，我們推測(cè)BM-MSCs可能在肝肺綜合征的肺血管新生過程中起一定作用。
　　Nf-E2相關(guān)因子2(Nrf2)是一種轉(zhuǎn)錄因子，可以激活各種抗

5、氧化反應(yīng)元件（ARE）依賴基因以應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)，在我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，CBDL手術(shù)3周后的大鼠肺組織中磷酸化Akt和ERK1水平增加，并且這些信號(hào)分子的磷酸化已被證明可以激活Nrf2。有研究已經(jīng)證實(shí)在氧化損傷情況下，Nrf2可以控制干細(xì)胞存活，并且Nrf2的活化程度在細(xì)胞復(fù)制沉寂期和衰老期間下降。此外，有研究還發(fā)現(xiàn)Nrf2的激活促進(jìn)了造血干細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)。
　　因此，本研究中，我們檢測(cè)了CBDL大鼠外周血中MSCs的數(shù)量

6、，探索了CBDL大鼠血清對(duì)BM-MSCs的促血管生成功能的影響，包括其定向遷移、增殖和旁分泌能力。
　　方法:
　　1.改良法CBDL手術(shù)構(gòu)建HPS大鼠模型以及原代BM-MSCs的培養(yǎng)
　　為了構(gòu)建HPS大鼠模型，相比之前的研究，我們使用了改進(jìn)后的方法對(duì)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(200-250g)進(jìn)行CBDL操作。假手術(shù)組動(dòng)物僅僅暴露膽總管但是不結(jié)扎。收集肺組織和外周血用于進(jìn)一步研究分析。從SD大鼠

7、的股骨和脛骨中分離原代BM-MSCs，并使用MSCs完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)3-5代后的BM-MSCs用于體外進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
　　2.PB-MSCs和BM-MSCs的CFU-F測(cè)定和流式細(xì)胞術(shù)鑒定
　　將所有分離的骨髓細(xì)胞以8×104/cm2的密度接種在25cm2培養(yǎng)瓶上，并在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對(duì)于PB-MSCs，則以4×105/cm2的細(xì)胞密度接種分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞。培養(yǎng)的第8天在顯微鏡下計(jì)數(shù)CFU-F的貼壁菌落（＞50

8、個(gè)細(xì)胞）。使用LSRⅡ流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)檢測(cè)表面標(biāo)志物，并用FlowJo軟件分析。
　　3.用CBDL大鼠血清處理的BM-MSCs中促血管生成功能的測(cè)定
　　體外培養(yǎng)的BM-MSCs分別用CBDL大鼠血清處理12小時(shí)，24小時(shí)和48小時(shí)。通過Western印跡檢測(cè)PCNA和CXCR4的蛋白表達(dá)水平，通過ELISA法測(cè)定BM-MSCs的VEGF旁分泌水平。此外，通過MTT和transwell試驗(yàn)測(cè)定其增

9、殖和遷移能力。
　　4.CBDL大鼠血清誘導(dǎo)Akt/Nrf2信號(hào)通路激活與BM-MSCs促血管生成功能增強(qiáng)的關(guān)系
　　體外培養(yǎng)的BM-MSCs用Nrf2siRNA轉(zhuǎn)染或用Akt或Erk抑制劑處理，然后分別用Sham大鼠及CBDL大鼠血清刺激。通過Western印跡法檢測(cè)p-Akt、p-Erk、Nrf2、PCNA和CXCR4的表達(dá)，通過ELISA法測(cè)定BM-MSCs的VEGF旁分泌水平。進(jìn)行transwell和MTT試驗(yàn)以進(jìn)一

10、步檢測(cè)BM-MSCs的增殖和遷移功能。
　　結(jié)果:
　　1.CBDL大鼠中MSCs的動(dòng)員增加
　　CBDL大鼠的外周血中獲取的MSCs，其CFU-F的平均值為10.2±3.6/106個(gè)細(xì)胞，相比之下，假手術(shù)大鼠的外周血中MSCs的CFU-F為1.4±0.8/106個(gè)細(xì)胞。然而，CBDL大鼠的和假大鼠骨髓中獲取的MSCs的CFU-F集落數(shù)之間沒有顯著差異，分別為每106個(gè)細(xì)胞有35.2±7.4和37.8±5.8個(gè)CFU-

11、Fs。
　　2.BM-MSCs和PB-MSCs的特征及鑒定
　　細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，大量的細(xì)胞簇隨機(jī)分布在培養(yǎng)板的底部。原代細(xì)胞在培養(yǎng)的第5天顯示出成纖維細(xì)胞樣的形態(tài)，并達(dá)到80％的融合率，在第7-8天時(shí)可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞集落。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BM-MSCs和PB-MSCs細(xì)胞對(duì)CD29和CD44標(biāo)記均顯示為陽性，而對(duì)CD34和CD45標(biāo)記均顯示為陰性。這些結(jié)果表明，BM-MSCs和PB-MSCs的特征是一樣的。
　　

12、3.CBDL大鼠血清促進(jìn)BM-MSCs中CXCR4，PCNA的表達(dá)及其旁分泌活性
　　CXCR4和PCNA分別是細(xì)胞定向遷移和增殖能力的指標(biāo)，Western印跡結(jié)果顯示它們的表達(dá)水平以時(shí)間依賴性方式顯著增加。與這一結(jié)果相一致，MTT測(cè)定結(jié)果也顯示在CBDL大鼠血清的作用下MSCs的增殖能力明顯提高。我們還發(fā)現(xiàn)，HPS組中血清刺激48小時(shí)后其VEGF旁分泌水平是對(duì)照組的185％，而單獨(dú)的HPS培養(yǎng)基中VEGF的含量與對(duì)照組培養(yǎng)基的量

13、相似，并顯著低于BM-MSCs條件培養(yǎng)基中VEGF的水平。
　　4.Akt/Nrf2信號(hào)通路介導(dǎo)了CBDL大鼠血清誘導(dǎo)的BM-MSCs增殖、遷移和旁分泌功能增強(qiáng)的作用
　　我們發(fā)現(xiàn)CBDL血清誘導(dǎo)后，BM-MSCs中Nrf2的蛋白表達(dá)及核轉(zhuǎn)位水平顯著增加，而在使用Akt抑制劑LY294002處理后，這種作用明顯減弱。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)Erk抑制劑PD98059卻沒有引起類似作用。另外，我們還發(fā)現(xiàn)阻斷Akt/Nrf2信號(hào)通路能夠明顯