Nrf--2信號(hào)通路在大鼠膿毒癥急性肝損傷中的作用研究.pdf

1、目的:通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)建立大鼠膿毒癥急性肝損傷(acute liverinjury，ALI)模型，以核因子E2相關(guān)因子2(Nrf-2)激動(dòng)劑萊菔硫烷(SEN)、抑制劑全反式維甲酸(ATRA)干預(yù)CLP模型，驗(yàn)證Nrf-2轉(zhuǎn)錄活性，明確Nrf-2信號(hào)通路在膿毒癥急性肝損傷時(shí)是否具有肝功能保護(hù)作用。
　　方法:SPF級(jí)SD大鼠共計(jì)128只，設(shè)置成假手術(shù)組、盲腸結(jié)扎穿孔組、萊菔硫烷組以及全反式維甲酸組。四組大鼠分別按時(shí)間點(diǎn)再

2、次平均分成6h、12h、18h及生存分析組四個(gè)亞組。假手術(shù)組大鼠麻醉后，用1ml注射器根據(jù)體重按5ml/kg劑量給予腹腔注射溶劑玉米油后關(guān)閉大鼠腹腔。盲腸結(jié)扎穿孔組大鼠，在距離盲腸盲端1/4盲腸全長(zhǎng)處用絲線結(jié)扎，然后用16G留置針在結(jié)扎段盲腸腸系膜對(duì)側(cè)總長(zhǎng)度的1/2和遠(yuǎn)端1/4點(diǎn)處各扎一孔，擠出部分腸內(nèi)容物，按5ml/kg劑量腹腔注射玉米油后關(guān)腹。萊菔硫烷組和全反式維甲酸組分別在CLP建模后腹腔注射SFN(5mg/kg)、ATRA(1m

3、g/kg)后關(guān)腹。各時(shí)間點(diǎn)經(jīng)心臟采血，離心獲取血清行轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)、總膽紅素水平檢測(cè)，處死大鼠后留取肝臟行組織形態(tài)學(xué)、炎癥因子、抗氧化酶水平測(cè)定及Western-Blot法檢測(cè)Nrf-2蛋白水平，RT-PCR法檢測(cè)目的基因Nrf-2以及抗氧化酶基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果:(1)大鼠血清AST、ALT、總膽紅素值的變化:
　　建模后6h，盲腸結(jié)扎穿孔組、萊菔硫烷組及全反式維甲酸組大鼠AST、ALT和總膽紅素值均較假手術(shù)

4、組升高;萊菔硫烷組大鼠總膽紅素值較盲腸結(jié)扎穿孔組降低，而全反式維甲酸組大鼠總膽紅素值較盲腸結(jié)扎穿孔組升高;全反式維甲酸組大鼠轉(zhuǎn)氨酶以及總膽紅素水平均較萊菔硫烷組升高。
　　建模后12h及18h，盲腸結(jié)扎穿孔組、萊菔硫烷組及全反式維甲酸組轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素值均較假手術(shù)組顯著升高;萊菔硫烷組數(shù)值較盲腸結(jié)扎穿孔組均有所降低，全反式維甲酸組數(shù)值較盲腸結(jié)扎穿孔組均有所升高;全反式維甲酸組數(shù)值較萊菔硫烷組則明顯升高。
　　(2)肝組織外觀

5、及病理HE染色:各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組大鼠肝臟大體形態(tài)正常，鏡下觀其結(jié)構(gòu)輪廓清晰，未見(jiàn)明確病理改變。盲腸結(jié)扎穿孔組、萊菔硫烷組和全反式維甲酸組大鼠肝臟鏡下可見(jiàn)不同程度損傷，且隨時(shí)間延長(zhǎng)呈加重趨勢(shì)，在同一時(shí)間點(diǎn)萊菔硫烷組病理改變范圍及嚴(yán)重程度較盲腸結(jié)扎穿孔組輕，全反式維甲酸組較盲腸結(jié)扎穿孔組重。
　　(3)肝組織勻漿炎癥因子值的變化:建模后各時(shí)間點(diǎn)，盲腸結(jié)扎穿孔組、萊菔硫烷組、全反式維甲酸組大鼠肝臟組織勻漿炎癥因子數(shù)值均較假手術(shù)組升高;萊

6、菔硫烷組數(shù)值較盲腸結(jié)扎穿孔組下降，而全反式維甲酸組數(shù)值較盲腸結(jié)扎穿孔組有所升高，全反式維甲酸組數(shù)值較萊菔硫烷組則明顯升高。
　　(4)肝組織勻漿抗氧化酶水平檢測(cè):
　　SOD活力檢測(cè)結(jié)果:建模后6h時(shí)間點(diǎn)盲腸結(jié)扎穿孔組比假手術(shù)組SOD活力水平增高，18h時(shí)間點(diǎn)較其下降;各時(shí)間點(diǎn)菜菔硫烷組、全反式維甲酸組SOD值分別比假手術(shù)組以和盲腸結(jié)扎穿孔組升高、下降，全反式維甲酸組SOD值比萊菔硫烷組明顯降低。
　　GSH-Px活力

7、檢測(cè)結(jié)果:盲腸結(jié)扎穿孔組與假手術(shù)組相比，建模后6h及12h時(shí)間點(diǎn)GSH-Px活力水平增高，18h時(shí)間點(diǎn)較其下降;各時(shí)間點(diǎn)萊菔硫烷組、全反式維甲酸組GSH-Px值分別比假手術(shù)組以和盲腸結(jié)扎穿孔組升高、下降，全反式維甲酸組GSH-Px值比萊菔硫烷組明顯降低。
　　(5)肝組織中Nrf-2蛋白表達(dá)情況:各時(shí)間點(diǎn)盲腸結(jié)扎穿孔組、萊菔硫烷組肝臟Nrf-2蛋白表達(dá)水平均較假手術(shù)組增高;萊菔硫烷組較盲腸結(jié)扎穿孔組也有所升高;全反式維甲酸組在18

8、h時(shí)間點(diǎn)較假手術(shù)組有所降低，同時(shí)各時(shí)間點(diǎn)全反式維甲酸組Nrf-2蛋白表達(dá)水平均較盲腸結(jié)扎穿孔組有所下降，較萊菔硫烷組明顯降低。
　　(6)肝組織中Nrf-2 mRNA、GSH-PXmRNA、SODmRNA表達(dá)水平:
　　Nrf-2 mRNA:各時(shí)間點(diǎn)盲腸結(jié)扎穿孔組、萊菔硫烷組均較假手術(shù)組增高，同時(shí)萊菔硫烷組、全反式維甲酸組分別較盲腸結(jié)扎穿孔組升高、下降，全反式維甲酸組較萊菔硫烷組明顯降低。
　　GSH-Px mRNA:

9、盲腸結(jié)扎穿孔組在6h、12h較假手術(shù)組增高;萊菔硫烷組在各時(shí)間點(diǎn)較假手術(shù)組、盲腸結(jié)扎穿孔組增高;全反式維甲酸組表達(dá)水平在18h時(shí)間點(diǎn)較假手術(shù)組降低，在各時(shí)間點(diǎn)較盲腸結(jié)扎穿孔組降低，較萊菔硫烷組明顯降低。
　　SOD mRNA:盲腸結(jié)扎穿孔組在6h、12h時(shí)間點(diǎn)均較假手術(shù)組增高，萊菔硫烷組在各時(shí)間點(diǎn)較假手術(shù)組與盲腸結(jié)扎穿孔組增高;全反式維甲酸組在12h、18h時(shí)時(shí)間點(diǎn)較假手術(shù)組降低，在各時(shí)間點(diǎn)較盲腸結(jié)扎穿孔組都有所下降，較萊菔硫烷組