AF9在高效蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)重編程BM-MSCs為心臟祖細(xì)胞中的作用.pdf

1、目的：心血管系統(tǒng)疾病(cardiaovascular disease，CVD)是威脅我國(guó)公眾健康的頭號(hào)殺手，遺憾的是，目前的治療策略只能延緩疾病進(jìn)展，不能讓失去的心肌細(xì)胞再生。近年來(lái)，多項(xiàng)臨床前和臨床試驗(yàn)證明心臟祖/干細(xì)胞(cardiac progenitor/stem cells，CPCs/CSCs)治療應(yīng)用于心臟再生修復(fù)是可行的、安全的。使用內(nèi)源性CPCs需要進(jìn)行心臟活檢，這對(duì)于危重患者具有較大的風(fēng)險(xiǎn)，因此，需要開(kāi)發(fā)獲取外源性心臟祖

2、細(xì)胞的方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)具有低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)等優(yōu)勢(shì)，已作為自體/同種異體干細(xì)胞治療的候選者。從譜系發(fā)育角度看，它和CPCs同起源于中胚層。BM-MSCs向心臟祖細(xì)胞方向誘導(dǎo)的重編程技術(shù)，將克服它低心臟分化潛能的缺陷，使之成為心臟修復(fù)的理想細(xì)胞類型。然而，在重編程過(guò)程中，染色質(zhì)狀態(tài)被認(rèn)為是跨越細(xì)胞表型的最大障礙。所以，尋找新的染色質(zhì)重塑因子是提

3、高心臟祖細(xì)胞重編程效率的突破口。本研究探究AF9在蛋白質(zhì)重編程BM-MSCs生成心臟祖細(xì)胞中的作用及其表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。
　　方法：1.將pSmartI-MLLT3表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株中，優(yōu)化AF9-His融合蛋白表達(dá)條件，利用親和層析柱純化AF9蛋白;
　　2.用納米蛋白轉(zhuǎn)染載體(CN201410823369.2)修飾重組蛋白GATA4、TBX5、NKX2.5、AF9，然后與BM-MSCs孵育12小時(shí)，免疫熒光

4、染色觀察納米載體遞shDOT1L-2載體成功沉默DOT1L的表達(dá)，顯著性抑制H3K79雙甲基化。ChIP-qPCR結(jié)果顯示了DOT1L的沉默，削弱了MYH6、MYH7啟動(dòng)子區(qū)域H3K79me2的富集。
　　結(jié)果和結(jié)論：AF9可作為有效的重編程因子，促進(jìn)心臟轉(zhuǎn)錄因子組合GNT誘導(dǎo)BM-MSCs重編程為CPCs，其可能的機(jī)制是AF9招募了DOT1L，在GATA4-AF9復(fù)合物的引導(dǎo)下，促進(jìn)心臟關(guān)鍵基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白H3K79發(fā)生二