腸肌纖維母細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在炎癥性腸病腸道纖維化及細(xì)胞重塑過(guò)程的作用.pdf

1、炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種特發(fā)性腸道炎癥性疾病，病變范圍累及回腸、回盲部、結(jié)腸以及直腸。臨床常表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、甚至血便，部分患者可有腸梗阻的癥狀。本病主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(crohn's disease，CD)。UC是結(jié)腸黏膜層和黏膜下層連續(xù)性炎癥，疾病通常先累及直腸，逐漸向全結(jié)腸蔓延。CD可累及全消化道，為非連續(xù)性全層炎癥，

2、最常累及部位為末端回腸及回盲部，部分累及結(jié)腸和肛周。
　　腸道纖維化是IBD的并發(fā)癥，也是腸腔狹窄導(dǎo)致的腸梗阻和手術(shù)的主要原因，主要病理特點(diǎn)為以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在腸道組織的過(guò)度合成以及異常沉積，病程不可逆轉(zhuǎn)。延緩腸道纖維化可改善IBD的自然病程，降低手術(shù)率。作為腸道纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，腸道成纖維細(xì)胞在炎癥初期的出現(xiàn)是損傷愈合的表現(xiàn)，但腸道纖維母細(xì)胞的過(guò)度增殖與活化，向肌成纖

3、維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及分泌大量以膠原為主的ECM和細(xì)胞因子，在腸道纖維化過(guò)程中同樣扮演了關(guān)鍵的角色。
　　近來(lái)，越來(lái)越多的研究證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在一些組織或者細(xì)胞的分化以及凋亡中起到重要的作用，且持續(xù)的ERS和多種器官組織如肝臟、肺、腎以及血管的纖維化有關(guān)，是這些器官組織纖維化的機(jī)制之一。但是腸道組織是否存在ERS，以及ERS在腸道纖維母細(xì)胞中的作用，目前鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。依據(jù)

4、先前的研究基礎(chǔ)，推測(cè)，IBD的腸道纖維化中，肌纖維母細(xì)胞的ERS在組織纖維化過(guò)程中起到重要作用。因此，本研究通過(guò)建立三硝基苯磺酸(2，4，6-Trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)誘導(dǎo)的小鼠IBD纖維化模型以及體外采用衣霉素(tunicamycin，TM)誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸纖維母細(xì)胞ERS的方法，在體內(nèi)以及體外觀察小鼠結(jié)腸纖維化組織以及纖維母細(xì)胞ERS標(biāo)志性蛋白，探討腸肌纖維母細(xì)胞ERS在炎癥性腸病腸道纖維化及細(xì)

5、胞重塑過(guò)程的作用。具體內(nèi)容概括如下：
　　第一部分 ERS相關(guān)蛋白在TNBS誘導(dǎo)的小鼠IBD腸纖維化模型中的動(dòng)態(tài)變化
　　研究目的：ERS相關(guān)蛋白在TNBS誘導(dǎo)的小鼠IBD腸纖維化模型中的動(dòng)態(tài)變化，探討ERS在小鼠UC腸纖維化中的作用。
　　研究方法：雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組，分別為正常組（control組，C組），TNBS組（T組），TNBS+TUDCA組（TT組）。C組給予生理鹽水灌腸作為對(duì)照，T組給予T

6、NBS每周灌腸1次造模，TT組在TNBS灌腸的基礎(chǔ)上，給予ERS保護(hù)劑?；切苋パ跄懰?tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)飼喂。三組動(dòng)物均分別于造模后的第1周，第2周以及第4周隨機(jī)處死，并取結(jié)腸組織進(jìn)行病理切片和蛋白提取處理。采用蘇木精-伊紅染色(HE染色)、馬松(Masson)三聯(lián)染色、免疫組化技術(shù)以及Western blot法觀察結(jié)腸組織的病理染色形態(tài)以及ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　研究結(jié)果：相比于

7、其他兩組，TNBS組的纖維化更為明顯，表現(xiàn)為腸黏膜下層纖維母細(xì)胞大量聚集，后期（灌腸四周后）膠原過(guò)度沉積，腸壁結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑。同時(shí)，ERS現(xiàn)象明顯。在加入ERS調(diào)節(jié)劑TUDCA后，ERS現(xiàn)象減輕，同時(shí)伴有纖維化的明顯緩解。
　　研究結(jié)論：TNBS可以成功誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸的纖維化，同時(shí)纖維化的過(guò)程有ERS的參與。通過(guò)調(diào)節(jié)ERS，可以顯著改善纖維化進(jìn)程。
　　第二部分 ERS對(duì)小鼠結(jié)腸纖維母細(xì)胞表型變化的調(diào)節(jié)以及TUDCA對(duì)纖維細(xì)胞母

8、ERS影響的體外研究.
　　研究目的：建立TM誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸纖維母細(xì)胞ERS體外模型，并在此基礎(chǔ)研究TUDCA在細(xì)胞層面上對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控作用。
　　研究方法：本部分實(shí)驗(yàn)分兩個(gè)部分。第一部分是提取原代小鼠結(jié)腸肌纖維母細(xì)胞，6周齡C57BL/6小鼠結(jié)腸采用組織塊貼壁法分離獲取纖維母細(xì)胞，并采用差速貼壁法進(jìn)行細(xì)胞的提純。第二部分是細(xì)胞模型的建立，將提取的纖維母細(xì)胞隨機(jī)分為4組，分別為正常組（control組，C組）、TM組、T

9、UDCA組、TM+TUDCA組，并通過(guò)CCK-8細(xì)胞毒力試驗(yàn)確定最適給藥濃度。采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中GRP78，CHOP以及α-SMA mRNA的表達(dá)變化，Western blot檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果：TM可導(dǎo)致結(jié)腸肌纖維母細(xì)胞ERS，發(fā)生ERS的纖維母細(xì)胞α-SMA的表達(dá)量明顯升高，提示細(xì)胞發(fā)生重塑，纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。ERS調(diào)節(jié)劑TUDCA可緩解ERS，并顯著改善纖維母細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)