刺槐素葡萄糖醛酸化代謝及外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　研究表明，刺槐素在體外易被UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(uridinediphosphoglucuronosyl transferases，UGTs)代謝，藥代動(dòng)力學(xué)研究亦顯示其以原型形式在體內(nèi)暴露較少，而其代謝物較多，預(yù)示刺槐素的體內(nèi)生物利用度較低。運(yùn)用Caco-2細(xì)胞模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示刺槐素的葡萄糖醛酸化代謝物很可能是乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP/Bcrp）

2、及多藥耐藥蛋白家族(multidrugresistance proteins，MRPs/Mrps)的底物。然而，有關(guān)刺槐素的體內(nèi)處置缺乏系統(tǒng)研究;外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP與MRPs對(duì)刺槐素葡萄糖醛酸化代謝物的調(diào)控仍未在體內(nèi)得到驗(yàn)證。因此，本實(shí)驗(yàn)采用藥代動(dòng)力學(xué)模型，腸灌流模型及組織分布模型開展對(duì)刺槐素體內(nèi)處置以及外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)代謝物調(diào)控的研究。
　　方法:
　　1.刺槐素在FVB小鼠及基因敲除小鼠藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)
　　刺槐素以

3、5 mg/kg分別灌胃FVB小鼠、Bcrp1(-/-)小鼠及Mrp2（-/-）小鼠，于預(yù)設(shè)的不同時(shí)間點(diǎn)采血，血漿樣品處理后測(cè)定刺槐素及代謝物的濃度。使用WinNonLin3.3非房室模型計(jì)算它們的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。并比較野生型FVB小鼠、及基因敲除小鼠的藥動(dòng)力學(xué)參數(shù)，統(tǒng)計(jì)這些參數(shù)差異是否具有顯著性。
　　2.FVB小鼠及基因敲除小鼠評(píng)價(jià)刺槐素的腸處置過程
　　動(dòng)物麻醉后，將膽管結(jié)扎，分別取其小腸及結(jié)腸灌流5μM刺槐素溶液，每隔

4、20min收集灌流液。灌流結(jié)束后，將膽囊中的膽汁收集于Ep管中，并采取斷尾取血。將灌流液、膽汁和血漿樣品處理后，分別測(cè)定這些樣品中刺槐素及代謝物的濃度。計(jì)算小腸段及結(jié)腸段刺槐素的有效滲透系數(shù)，并比較FVB小鼠及Bcrp1（-/-）小鼠及Mrp2（-/-）小鼠樣品中代謝物濃度，判斷是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.刺槐素在FVB小鼠及基因敲除小鼠的肝臟組織分布測(cè)定
　　為考察刺槐素在小鼠體內(nèi)肝臟組織的分布水平，實(shí)驗(yàn)使用FVB小鼠，

5、Bcrp1（-/-）小鼠及Mrp2（-/-）小鼠，單次口服5 mg/kg刺槐素，于給藥5min后將小鼠麻醉，摘眼球取血于肝素化Ep管后立刻處死。隨后摘取肝臟制成勻漿液，測(cè)定刺槐素及代謝物的濃度。
　　4.基因敲除對(duì)小鼠肝腸UGT酶活性的影響評(píng)價(jià)
　　制備來源于FVB小鼠、Bcrp1（-/-）小鼠及Mrp2（-/-）小鼠肝腸S9片段，采用濃度0.25 mg/kg的S9片段與刺槐素(濃度分別為2.5μM，10μM，40μM)在3

6、7℃水浴鍋上孵育。有機(jī)溶劑終止反應(yīng)后，測(cè)定反應(yīng)體系代謝物的量。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計(jì)方法為Student's test或One-way ANOVE，顯著性標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1.刺槐素在FVB小鼠及基因敲除小鼠的藥代動(dòng)力學(xué)特征
　　刺槐素給藥FVB小鼠后，達(dá)峰時(shí)間非?？?5-15 min)，但在血漿中的濃度較低。刺槐素能迅

7、速生成刺槐素-7-葡萄糖醛酸苷(Aca-7-Glu)及刺槐素-5-葡萄糖醛酸苷(Aca-5-Glu)，在血漿中這些代謝物為主要暴露形式。其中Aca-7-Glu的濃度是Aca-5-Glu的5-8倍。相比野生型FVB小鼠，Aca-7-Glu的曲線下面積(AUC)在Mrp2（-/-）小鼠中增加了5倍(p＜0.05)，在Bcrp1（-/-）小鼠中增加了1倍(p＜0.05)，而清除率(CL)顯著降低(p＜0.05)。Mrp2敲除導(dǎo)致Aca-7-G

8、lu半衰期顯著增長(zhǎng)(p＜0.05)。Aca-5-Glu在Bcrp1（-/-）小鼠中AUC顯著高于野生型FVB小鼠(p＜0.05)。
　　2.刺槐素在FVB小鼠及基因敲除小鼠腸處置特征
　　選取小腸及結(jié)腸灌流刺槐素溶液，F(xiàn)VB小鼠及基因敲除小鼠經(jīng)灌流實(shí)驗(yàn)，有效滲透系數(shù)均大于1。在灌流液、血漿及膽汁中均能檢測(cè)到Aca-7-Glu，而Aca-5-Glu低于定量下限。在小腸灌流液中，Aca-7-Glu較多，而結(jié)腸中很少。在Bcrp1

9、（-/-）小鼠或Mrp2（-/-）小鼠小腸灌流液中，Aca-7-Glu均顯著低于野生型FVB小鼠(p＜0.05)，且在Bcrp1（-/-）小鼠結(jié)腸中檢測(cè)不到Aca-7-Glu。
　　3.刺槐素在FVB小鼠及基因敲除肝臟組織分布特征
　　在肝臟組織中檢測(cè)到大量刺槐素及Aca-7-Glu。刺槐素在Mrp2（-/-）小鼠肝臟中的濃度是FVB小鼠的0.5倍(p＜0.05)，在血漿中無差異。Aca-7-Glu在Mrp2（-/-）小鼠肝

10、臟中濃度是FVB小鼠的4倍(p＜0.05)，在血漿中的濃度是FVB小鼠的8倍(p＜0.05)。在Bcrp1（-/-）小鼠肝臟及血漿中，刺槐素與Aca-7-Glu的濃度與FVB小鼠相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.肝腸UGT酶在Bcrp1（-/-）小鼠及Mrp2（-/-）小鼠的活性研究在Bcrp1(-/-)小鼠及Mrp2（-/-）小鼠中，低、中、高底物濃度下肝臟酶活性與野生型FVB小鼠相比均顯著降低(p＜0.05）。而小腸酶活性在低底物

11、濃度下顯著升高(p＜0.05)，在中濃度及高濃度下無差異。
　　結(jié)論:
　　1.刺槐素在血漿中主要以其代謝物形式存在，Bcrp及Mrp2敲除可致Aca-7-Glu的AUC顯著升高，CL顯著降低。
　　2.刺槐素在小腸易代謝產(chǎn)生Aca-7-Glu。Bcrp及Mrp2敲除顯著減少Aca-7-Glu腸道外排。
　　3.刺槐素給藥后，刺槐素及Aca-7-Glu在肝臟組織暴露水平較高。敲除Mrp2導(dǎo)致血漿及肝臟組織中Aca