含離子液體介質(zhì)中重組β-D-葡萄糖醛酸苷酶催化合成單葡萄糖醛酸基甘草次酸的研究.pdf

1、甘草酸（Glycyrrhizin，GL）是重要中藥甘草的主要有效成分之一，利用β-D-葡萄糖醛酸苷酶對甘草酸進行改性得到生物利用度更高的單葡萄糖醛酸甘草次酸（Glycyrrhetic acid 3-O-mono-β-D-glucuronide，GAMG）具有重要的研究價值和良好的應(yīng)用前景。離子液體（Ionic liquids，Ils）是一種新型可設(shè)計性溶劑，由陰陽離子構(gòu)成且在常溫下呈液態(tài)，具有穩(wěn)定性好、溶解性強、不揮發(fā)等優(yōu)點，以綠色環(huán)保

2、的離子液體替代傳統(tǒng)的易揮發(fā)有毒溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)具有重要意義。本論文研究了在含離子液體的介質(zhì)體系中充分利用重組β-D-葡萄糖醛酸苷酶生物轉(zhuǎn)化甘草酸合成GAMG，對離子液體的合成與篩選、含離子液體體系中β-D-葡萄糖醛酸苷酶的催化活性、化學(xué)鍵選擇性、熱穩(wěn)定性及催化反應(yīng)動力學(xué)等進行了探討，主要結(jié)果如下：
　　 （1）離子液體的合成：首先，以N-甲基咪唑、吡啶和溴代烷為原料，在超聲波輔助且無溶劑條件下合成了四種離子液體中間體：1-乙基-

3、3-甲基咪唑溴鹽（[EMIMBr）、1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽（[BMIM]Br）、N-乙基吡啶溴鹽（[Epy]Br）、N-丁基吡啶溴鹽（[Bpy]Br），對其進行了熔點測試、元素分析、IR、1H NMR、13CNMR表征；其次，以[EMIM]Br、[BMIM]Br、[Epy]Br、[Bpy]Br為中間體，通過陰離子交換制備了親水性離子液體[EMIM]BF4、[BMIM]BF4、[Epy]BF4、[Bpy]BF4及疏水性離子液體[BMI

4、M]PF6；最后，對合成的5種離子液體進行了元素分析、IR、1H NMR和13CNMR表征，并對其黏度進行了測定。結(jié)果表明，溫度對合成的五種離子液體的黏度均有很大的影響，且黏度隨著溫度的升高而迅速降低，在30～40 ℃下，黏度隨著溫度的升高幾乎呈線性下降趨勢，繼續(xù)升高溫度黏度的降低幅度越來越小。
　　 （2）含離子液體介質(zhì)體系的篩選與優(yōu)化：將離子液體[BMIM]Br、[EMIM]BF4、[BMIM]BF4、[Epy]BF4、[B

5、py]BF4和[BMIM]PF6純?nèi)軇┓謩e作為β-D-葡萄糖醛酸苷酶生物轉(zhuǎn)化甘草酸合成GAMG的反應(yīng)介質(zhì)時，底物甘草酸的轉(zhuǎn)化率都很低（均小于20％），遠遠小于緩沖液中甘草酸的轉(zhuǎn)化率（46.01％）。當(dāng)以10％（v/v）離子液體/緩沖液混合溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)時，甘草酸的轉(zhuǎn)化率均大幅度提高至原來的2～3倍。其中，10％（v/v）[BMIM]PF6/緩沖液兩相體系和10％（v/v）[EMIM]BF4/緩沖液均相體系中甘草酸的轉(zhuǎn)化率分別達到57.

6、13％和54.23％，遠遠超過了緩沖液中的轉(zhuǎn)化率，因而被選為合適的含離子液體介質(zhì)體系。經(jīng)初步優(yōu)化，40％（v/v）[BMIM]PF6/緩沖液兩相體系中反應(yīng)初速度、GAMG產(chǎn)率、甘草酸轉(zhuǎn)化率、化學(xué)鍵選擇性分別為2.9 mMh-1、71.71％、72.62％、98.76％。
　　 （3）[BMIM]PF6/緩沖液兩相體系中β-D-葡萄糖醛酸苷酶的催化特性研究：[BMIM]PF6/緩沖液兩相體系中β-D-葡萄糖醛酸苷酶能高效地催化甘草

7、酸水解生成GAMG，其反應(yīng)初速度和化學(xué)鍵選擇性受諸多因素的影響。該催化體系的最適[BMIM]PF6濃度、緩沖液pH、反應(yīng)溫度、底物濃度和振蕩速度分別為40％、6.0、50 ℃、6 mM和200 rpm；在此條件下，反應(yīng)初速度、GAMG產(chǎn)率和化學(xué)鍵選擇性（Scb）分別達到3.15mMh-1，74.36％和 98.12％。[BMIM]PF6/緩沖液兩相體系中主產(chǎn)物GAMG分布在上層緩沖液相，副產(chǎn)物甘草次酸（Glycyrrhetinic Ac

8、id，GA）則在下層離子液體相，GAMG與GA達到初步分離的效果。[BMIM]PF6的重復(fù)利用性研究結(jié)果表明，循環(huán)利用5次以后其回收率仍高達92％以上。另外，[BMIM]PF6/緩沖液兩相反應(yīng)體系中的表觀米氏常數(shù)Km及活化能Ea比較低，Vmax較大，分別為1.21 mM、25.97 kJmol-1和3.14 mMh-1。
　　 （4）[EMIM]BF4/緩沖液均相體系中β-D-葡萄糖醛酸苷酶的催化特性研究：[EMIM]BF4/緩

9、沖液均相體系中β-D-葡萄糖醛酸苷酶能夠高效地催化甘草酸水解生成GAMG。經(jīng)過優(yōu)化得到該反應(yīng)體系的最適[EMIM]BF4濃度、緩沖液pH、反應(yīng)溫度、底物濃度分別為11％、5.4、45℃和4 mM。在上述條件下反應(yīng)24 h后，反應(yīng)初速度、產(chǎn)物GAMG產(chǎn)率和化學(xué)鍵選擇性分別為2.76 mMh-1、95.31％和61.81％。以11％（v/v）[EMIM]BF4/緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，底物存在時β-D-葡萄糖醛酸苷酶的熱穩(wěn)定性比沒有底物存在時要高

10、。與緩沖液反應(yīng)體系相比，[EMIM]BF4/緩沖液均相體系中β-D-葡萄糖醛酸苷酶催化甘草酸水解反應(yīng)的表觀米氏常數(shù)Km（0.85mM）、Vmax（2.22 mMh-1）及活化能Ea（9.96 kJmol-1）均較低，但Vmax/Km值則是緩沖液中的2.04倍。
　　 本研究表明，在綠色環(huán)保的含IL介質(zhì)體系中利用β-D-葡萄糖醛酸苷酶催化合成GAMG時反應(yīng)速度快、產(chǎn)物收率高、化學(xué)選擇性強，相關(guān)結(jié)果對于重要可再生資源甘草的開發(fā)利用具