黃酮類(lèi)化合物葡萄糖醛酸化和硫酸化代謝機(jī)理及其對(duì)P-糖蛋白的作用研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 黃酮類(lèi)化合物(flavonoids)是廣泛存在于自然界中的一類(lèi)重要的天然有機(jī)化合物，許多食物例如水果、蔬菜和藥材中都含有黃酮類(lèi)化合物。黃酮類(lèi)化合物具有廣泛的藥理作用，主要包括對(duì)心血管的作用，對(duì)消化系統(tǒng)的作用，對(duì)呼吸系統(tǒng)的作用，抗炎抗免疫作用，雌激素樣作用，鎮(zhèn)痛作用，抗腫瘤作用及對(duì)酶的影響等。盡管黃酮類(lèi)化合物對(duì)人體的健康十分有益，其在人體內(nèi)較低的生物利用度（基本上小于5％）卻制約了黃酮類(lèi)化合物的充分利用。<

2、br>　　 研究表明，黃酮類(lèi)化合物生物利用度低的主要原因是由于其在體內(nèi)存在廣泛的Ⅱ相代謝，這些Ⅱ相代謝產(chǎn)物隨后被生物體的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白迅速排出細(xì)胞外，從而造成機(jī)體內(nèi)可被利用的黃酮來(lái)化合物的量極少。研究黃酮類(lèi)化合物的吸收、分布、代謝、排泄(ADME)，尤其是從代謝環(huán)節(jié)出發(fā)，研究黃酮類(lèi)化合物Ⅱ相反應(yīng)的代謝機(jī)理，并研究其與藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的相互作用，是改善黃酮類(lèi)化合物在機(jī)體內(nèi)生物利用度的關(guān)鍵因素。黃酮類(lèi)化合物的Ⅱ相代謝方式主要是葡萄糖醛酸

3、化代謝和硫酸化代謝。由于黃酮類(lèi)化合物的硫酸化代謝產(chǎn)物極難在生物體液中檢測(cè)出，因此過(guò)去的研究多數(shù)側(cè)重于黃酮類(lèi)化合物的葡萄糖醛酸化代謝，而對(duì)硫酸化代謝反應(yīng)在黃酮類(lèi)化合物代謝中的重要性則研究較少。
　　 本研究從黃酮類(lèi)化合物的葡萄糖醛酸化與硫酸化代謝反應(yīng)出發(fā)，選擇黃酮類(lèi)化合物作為研究對(duì)象，考察結(jié)構(gòu)相似而羥基取代位置不同的幾種黃酮類(lèi)化合物，在FVB小鼠腸道S9中葡萄糖醛酸化與硫酸化反應(yīng)是否存在相互競(jìng)爭(zhēng)/協(xié)同關(guān)系;研究黃酮類(lèi)化合物在人肝S

4、9與C57小鼠肝臟S9中的葡萄糖醛酸化與硫酸化反應(yīng)特征，考察黃酮類(lèi)化合物的Ⅱ相代謝反應(yīng)在不同種屬間是否存在差異。同時(shí)，考慮到藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在黃酮類(lèi)化合物的代謝過(guò)程中具有不可忽視的作用，我們選擇生物體內(nèi)分布最廣、具有底物最多的P-糖蛋白(P-gp)，考察黃酮類(lèi)化合物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞LS174T細(xì)胞內(nèi)P-gp的表達(dá)及活性的影響，從而進(jìn)一步解釋黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)與其代謝特征及藥理活性之間的關(guān)系。
　　 方法:
　　 1.為考察

5、參與黃酮類(lèi)化合物Ⅱ相代謝的藥物代謝酶Ugts和Sults在黃酮代謝過(guò)程中是否存在協(xié)同或競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，以及這兩種代謝酶對(duì)黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)是否存在選擇性和專(zhuān)屬型，選擇7種化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的黃酮類(lèi)化合物，5-羥基黃酮(5-HF)，6-羥基黃酮(6-HF)，7-羥基黃酮(7-HF)，5，6-二羥基黃酮(5，6-diHF)，5，7-二羥基黃酮(5，7-diHF)，6，7-二羥基黃酮(6，7-diHF)和5，6，7-三羥基黃酮(5，6，7-THF)作為研

6、究對(duì)象，建立FVB小鼠在體腸灌流模型和三種FVB小鼠小腸S9體外孵育酶反應(yīng)體系。小鼠的在體腸灌流模型由已經(jīng)運(yùn)用成熟的大鼠在體腸灌流模型改造而來(lái)。大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)是在手術(shù)后動(dòng)物處于完全麻醉的狀態(tài)下進(jìn)行的，此模型有效地對(duì)應(yīng)于人體空腸灌流模型。對(duì)于黃酮類(lèi)化合物的Ⅱ相代謝反應(yīng)，大鼠腸灌流模型只能檢測(cè)到黃酮類(lèi)化合物的葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物，而較難檢測(cè)出其硫酸化代謝產(chǎn)物，這使得該模型難以模擬黃酮類(lèi)化合物在人體腸道內(nèi)的硫酸化代謝反應(yīng)，而小鼠腸灌流

7、模型則可以解決此問(wèn)題。考察實(shí)驗(yàn)所選的黃酮類(lèi)化合物在小鼠小腸與結(jié)腸部位的葡萄糖醛酸化與硫酸化代謝產(chǎn)物在灌流過(guò)程中的排出速率，可以1）比較羥基取代位置不同的黃酮類(lèi)化合物發(fā)生Ⅱ相代謝的反應(yīng)特征，如Ugts和Sults代謝酶對(duì)黃酮類(lèi)化合物的不同位置的羥基是否有選擇性和專(zhuān)屬性;2）比較黃酮類(lèi)化合物的葡萄糖醛酸化代謝反應(yīng)和硫酸化代謝反應(yīng)在小鼠不同部位腸道（小腸與結(jié)腸）是否存在不同的代謝產(chǎn)物外排速率，推測(cè)小鼠小腸和結(jié)腸所含藥物代謝酶有無(wú)不同;3）比較

8、黃酮類(lèi)化合物的葡萄糖醛酸化代謝反應(yīng)和硫酸化代謝反應(yīng)在小鼠不同部位腸道（小腸與結(jié)腸）是否存在不同的代謝產(chǎn)物外排速率，推測(cè)小鼠小腸和結(jié)腸所含藥物外排蛋白有無(wú)不同。
　　 建立三種黃酮類(lèi)化合物在FVB小鼠小腸S9中的體外孵育酶反應(yīng)體系:1）黃酮類(lèi)化合物在小腸S9中硫酸化代謝單獨(dú)反應(yīng)體系。體系中，小腸S9提供藥物發(fā)生反應(yīng)所需的硫酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶，PAPS為藥物發(fā)生結(jié)合的硫酸基團(tuán)供體，KPI緩沖液為藥物發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的緩沖體系，整個(gè)體系模擬生物

9、體溫度于37℃下水浴進(jìn)行。反應(yīng)一定時(shí)間后，在反應(yīng)體系中加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)進(jìn)行，處理樣品并進(jìn)行UPLC分析，測(cè)定反應(yīng)體系中剩余的黃酮類(lèi)化合物原型藥物及產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物量，計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)單位酶濃度黃酮類(lèi)化合物所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物量為藥物的代謝反應(yīng)速率。隨行進(jìn)行空白對(duì)照反應(yīng)。2）黃酮類(lèi)化合物在小腸S9中的葡萄糖醛酸化代謝單獨(dú)反應(yīng)體系。參考黃酮類(lèi)化合物硫酸化代謝反應(yīng)體系，改變反應(yīng)體系中的硫酸基團(tuán)供體PAPS為葡萄糖醛酸基團(tuán)供體UDPGA，并根據(jù)藥

10、物反應(yīng)速率改變反應(yīng)所需的時(shí)間和S9中酶濃度，其他條件與操作維持不變，計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)單位酶濃度黃酮類(lèi)化合物所產(chǎn)生的葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物量為藥物發(fā)生葡萄糖醛酸化代謝反應(yīng)的速率。3）黃酮類(lèi)化合物在小腸S9中的硫酸化與葡萄糖醛酸化聯(lián)合反應(yīng)體系。參考上述兩種反應(yīng)體系，在S9反應(yīng)體系中同時(shí)為黃酮類(lèi)化合物提供硫酸基團(tuán)與葡萄糖醛酸基團(tuán)的供體，并調(diào)節(jié)反應(yīng)時(shí)間與酶濃度以達(dá)到藥物分析測(cè)定的要求，其他條件與操作維持不變，分別計(jì)算黃酮類(lèi)化合物發(fā)生硫酸化代謝與葡萄

11、糖醛酸化代謝反應(yīng)的速率，并將之與單獨(dú)反應(yīng)體系中計(jì)算出的反應(yīng)速率比較，比較硫酸化代謝反應(yīng)與葡萄糖醛酸化代謝反應(yīng)在單獨(dú)反應(yīng)體系與聯(lián)合反應(yīng)體系中的異同。
　　 將小鼠灌流實(shí)驗(yàn)中所獲得的黃酮類(lèi)化合物硫酸化代謝產(chǎn)物與葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物在腸道內(nèi)的排出速率與體外S9孵育實(shí)驗(yàn)獲得的兩種代謝反應(yīng)產(chǎn)物的生成速率進(jìn)行擬合，比較體外反應(yīng)模型是否與在體實(shí)驗(yàn)所獲得的結(jié)果一致，并分析其原因。
　　 2.選擇4種單羥基黃酮，3-羥基黃酮(3-HF)，

12、5-羥基黃酮（5-HF），7-羥基黃酮（7-HF）和4'-羥基黃酮(4'-HF)，3種雙羥基黃酮，3，5-二羥基黃酮(3，5-diHF)，3，4'-二羥基黃酮(3，4'-diHF)和3，7-二羥基黃酮(3，7-diHF)，采用肝臟S9孵育模型，考察黃酮類(lèi)化合物在體外人肝S9中的葡萄糖醛酸化與硫酸化代謝特征。同時(shí)，采用C57小鼠肝臟S9孵育模型，比較黃酮類(lèi)化合物的葡萄糖醛酸化和硫酸化在人肝S9與小鼠肝臟S9中的代謝特征是否存在種屬間差異。

13、采用C57小鼠腸灌流模型與C57小鼠S9孵育模型，考察黃酮類(lèi)化合物分別在在體腸灌流與體外S9孵育模型中的葡萄糖醛酸化與硫酸化代謝反應(yīng)特征，將黃酮類(lèi)化合物在腸灌流模型中代謝產(chǎn)物的排出速率與體外孵育模型中葡萄糖醛酸化與硫酸化代謝產(chǎn)物的生成速率進(jìn)行比較，并計(jì)算體內(nèi)外反應(yīng)的相關(guān)系數(shù)。
　　 3.為考察黃酮類(lèi)化合物對(duì)介導(dǎo)藥物在腸道外排與轉(zhuǎn)運(yùn)的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp的表達(dá)和活性是否有影響，選擇5，7-diHF和5，6，7-THF，采用LS17

14、4T細(xì)胞模型，用以上黃酮類(lèi)化合物處理人結(jié)腸癌細(xì)胞LS174T細(xì)胞6天以上，并用蛋白免疫印跡法(WesternBlot)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的P-gp蛋白在藥物處理前后的表達(dá)量變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.考察FVB小鼠小腸S9中7種所試黃酮類(lèi)化合物的葡萄糖醛酸化與硫酸化反應(yīng)特征。每個(gè)黃酮類(lèi)化合物的葡萄糖醛酸化硫酸化反應(yīng)均考察3個(gè)不同濃度（10，20，和40μM）。其中，20μM濃度下各黃酮類(lèi)化合物的反應(yīng)速率用于描述其反應(yīng)特征。<

15、br>　　 結(jié)果顯示，無(wú)論是葡萄糖醛酸化反應(yīng)還是硫酸化反應(yīng)，結(jié)構(gòu)中帶有7-OH的黃酮類(lèi)化合物，其7-OH位將優(yōu)先于其他位置的羥基發(fā)生葡萄糖醛酸化與硫酸化結(jié)合反應(yīng)。當(dāng)黃酮類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)中不含7-OH時(shí)，對(duì)單羥基黃酮，其結(jié)合反應(yīng)只發(fā)生在羥基位置，而對(duì)雙羥基黃酮如5，6-diHF，則5-位和6-位均有可能發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。其發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的速率沒(méi)有顯著性差異。在FVB小鼠小腸S9中的硫酸化結(jié)合反應(yīng)中，各黃酮類(lèi)化合物在20μM濃度下反應(yīng)速率最大者為6

16、，7-diHF（反應(yīng)產(chǎn)物為7-O-S），同時(shí)6，7-diHF的硫酸化結(jié)合反應(yīng)在相應(yīng)的小腸灌流實(shí)驗(yàn)中其代謝產(chǎn)物的排出速率也是最快的。對(duì)葡萄糖醛酸化結(jié)合反應(yīng)，其反應(yīng)速率最大者為5，6，7-THF（反應(yīng)產(chǎn)物為7-O-G）。
　　 單獨(dú)反應(yīng)系統(tǒng)中的反應(yīng)速率與硫酸化與葡糖醛酸化聯(lián)合反應(yīng)體系中的硫酸化反應(yīng)速率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，聯(lián)合反應(yīng)體系中的硫酸化反應(yīng)速率有顯著提高（每個(gè)實(shí)驗(yàn)黃酮在10、20、40μM濃度下，t檢驗(yàn)結(jié)果均P＜0.05），且

17、7種黃酮類(lèi)化合物的反應(yīng)速率的快慢順序也有改變。而葡糖醛酸化反應(yīng)的反應(yīng)速率則與單獨(dú)反應(yīng)體系的速率基本一致。
　　 小鼠腸灌流模型考察的6種黃酮類(lèi)化合物，在小腸的葡糖醛酸化代謝產(chǎn)物與硫酸化代謝產(chǎn)物的排出速率均顯著大于相應(yīng)產(chǎn)物在結(jié)腸的排出速率(P＜0.05)，暗示小腸與結(jié)腸所含有的Ugts和Sults酶量或者外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白量存在差異。在小腸中，除6，7-diHF外，黃酮類(lèi)化合物的葡萄糖醛酸化結(jié)合產(chǎn)物的排出速率與硫酸化結(jié)合產(chǎn)物的排出速率存

18、在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且顯著大于相應(yīng)苷元的硫酸化結(jié)合產(chǎn)物的排出速率(P＜0.05);而在結(jié)腸中，黃酮類(lèi)化合物的硫酸化結(jié)合產(chǎn)物的排出速率與相應(yīng)的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物的排出速率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各黃酮的硫酸化結(jié)合產(chǎn)物的排出速率顯著大于相應(yīng)苷元的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物的排出速率(P＜0.05)，說(shuō)明在小鼠的結(jié)腸中，硫酸化代謝反應(yīng)是比葡糖醛酸化代謝反應(yīng)更重要的代謝形式。
　　 比較所試黃酮類(lèi)化合物FVB小鼠腸灌流實(shí)驗(yàn)中小腸部位與在FVB小鼠小腸S9體外孵育實(shí)

19、驗(yàn)所獲得的葡萄糖醛酸化反應(yīng)與硫酸化反應(yīng)特征，我們發(fā)現(xiàn)，體外孵育反應(yīng)并不能很好的模擬黃酮類(lèi)化合物在小鼠體內(nèi)的代謝反應(yīng)。經(jīng)計(jì)算，體外實(shí)驗(yàn)的硫酸化反應(yīng)速率與在體灌流實(shí)驗(yàn)的硫酸化反應(yīng)速率的相關(guān)系數(shù)為0.6767。然而，對(duì)于葡萄糖醛酸化結(jié)合反應(yīng)來(lái)說(shuō)，體外模擬實(shí)驗(yàn)與在體灌流實(shí)驗(yàn)之間不存在顯著相關(guān)性。這可能與整體動(dòng)物腸道中存在的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)。
　　 2.考察3-HF，5-HF，7-HF，4'-HF，3，5-diHF，3，4'-diHF和3

20、，7-diHF在人肝S9、C57小鼠肝臟和小腸S9孵育體系中的葡萄糖醛酸化與硫酸化反應(yīng)特征。每個(gè)黃酮類(lèi)苷元的葡萄糖醛酸化硫酸化反應(yīng)均考察3個(gè)不同濃度(5，10，和40μM)。其中，10μM濃度下各黃酮類(lèi)化合物的反應(yīng)速率用于描述其反應(yīng)特征。
　　 結(jié)果顯示，在七個(gè)黃酮類(lèi)化合物中，葡萄糖醛酸化與硫酸化反應(yīng)均較易發(fā)生在7-OH和4'-OH位置，而3-OH位則不會(huì)發(fā)生硫酸化反應(yīng)。比較人與小鼠S9中的硫酸化與葡萄糖醛酸化反應(yīng)的種屬差異，結(jié)

21、果表明，七種單羥基黃酮與雙羥基黃酮在人肝S9與C57小鼠肝臟S9中的葡萄糖醛酸化與硫酸化反應(yīng)速率存在種屬差異，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。七個(gè)黃酮類(lèi)化合物中，硫酸轉(zhuǎn)移酶活性最高在人肝S9中。同時(shí)，人肝S9中3，7-diHF生成7-O-G的葡萄糖醛酸化反應(yīng)速率幾乎是C57小鼠肝S9中的7-40倍。相反的，人肝S9中4'-HF的葡萄糖醛酸化反應(yīng)速率則較C57小鼠肝臟S9中低。這種現(xiàn)象說(shuō)明種屬差異會(huì)因底物化合物的羥基取代位置不同而有

22、所不同。
　　 將黃酮類(lèi)化合物在C57小鼠腸灌流模型中代謝產(chǎn)物的排出速率與體外孵育模型中葡萄糖醛酸化與硫酸化代謝產(chǎn)物的生成速率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，硫酸化代謝產(chǎn)物的體內(nèi)排出速率與其在體外S9中生成速率的相關(guān)系數(shù)為0.9834。同時(shí)，小腸中黃酮類(lèi)化合物葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物的排出速率與體外小腸S9中生成速率也具有較弱相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)為0.7988）。
　　 3.Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5，7-diHF和5，6，7-

23、THF在處理人結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞6天后，5，7-diHF與5，6，7-THF影響后的細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的P-gp表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，5，7-diHF在10μM(t=4.805，P=0.041)和20μM(t=6.315，P=0.024)濃度下可抑制P-gp表達(dá)，而5，6，7-THF在50μM濃度(t=-4.473，P=0.047)下可測(cè)得細(xì)胞內(nèi)P-gp蛋白表達(dá)顯著升高。
　　 結(jié)論:
　　 黃酮類(lèi)化合物