鵝去氧膽酸衍生物HS-1200抑制大鼠原發(fā)性肝癌及HepG2裸鼠肝癌移植瘤的研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥死亡的主要原因。其發(fā)病率高，預(yù)后差，僅2012年，全球就約有782500例新的原發(fā)性肝癌病例發(fā)生，同時約有745500例肝癌死亡病例發(fā)生。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原發(fā)性肝癌患者的多數(shù)。由于原發(fā)性肝細(xì)胞癌具有高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率，盡管近年的診斷和治療方法取得了相當(dāng)大的的進(jìn)步，但死亡率仍然很高。目前用于預(yù)防肝癌藥物的數(shù)量是很有

2、限的，而且很多的藥物仍然僅處于臨床試驗(yàn)階段，所以當(dāng)務(wù)之急是研究和發(fā)現(xiàn)新的肝癌藥物和方法，希望我們的研究能為肝癌預(yù)防和治療提供新的思路。
　　目前親水性膽汁酸的抗癌作用日益得到人們的關(guān)注。熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)屬于親水性膽汁酸，很多證據(jù)表明它可以抑制體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株增殖，降低大鼠肝癌模型的肝癌發(fā)生率，它還可以降低丙型肝炎患者罹患肝癌的風(fēng)險，并改善原發(fā)性膽汁性肝硬化病人的預(yù)后。鵝去氧膽酸(

3、chenodeoxycholic acid，CDCA)是已知的最豐富的初級膽汁酸，它可以減少膳食膽固醇吸收，并使膽固醇結(jié)石溶解，其衍生物HS-1200是親水性膽汁酸的新成員。現(xiàn)已報道鵝去氧膽酸衍生物HS-1200{N-[(3α，5β，7α)-3，7-二羥基-24氧代膽甾烷-24-基]β-丙氨酸芐酯}在數(shù)種人類癌癥中顯示其抗癌活性，HS-1200可以在人前列腺癌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡并抑制癌細(xì)胞增殖，而且可以誘導(dǎo)人肝

4、癌細(xì)胞株BEL7402、HepG2凋亡。然而，HS-1200對生物體內(nèi)肝癌是否有潛在的抗癌作用尚未闡明。為此，我們建立了兩種動物肝癌模型，分別通過口服和腹腔注射兩種給藥途徑來驗(yàn)證HS-1200對生物體內(nèi)肝癌的作用。
　　第一部分:鵝去氧膽酸衍生物HS-1200抑制二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠原發(fā)性肝癌的實(shí)驗(yàn)研究
　　研究目的:
　　雖然肝癌發(fā)展的分子機(jī)制仍然未全部為人所知，但DNA氧化損傷被認(rèn)為是參與人類肝癌發(fā)生和進(jìn)展的重要

5、原因。氧化應(yīng)激由于過度生產(chǎn)活性氧(reactiveoxygen species，ROS)等自由基被認(rèn)為引起遺傳不穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致致癌作用。8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)是一種被人們廣泛接受的ROS觸發(fā)氧化損傷DNA的損傷標(biāo)記物，同時也被確定為慢性丙型肝炎病毒感染者進(jìn)一步發(fā)展為肝細(xì)胞癌的危險因素。MTH1(mutT homolog1)基因是肝細(xì)胞DNA修復(fù)基因，編碼的MTH1蛋白通過抑制8-OHdG錯并入DNA鏈而有利于氧化誘導(dǎo)的DNA

6、損傷的修復(fù)。腫瘤組織中MTH1的上調(diào)表達(dá)可以消除腫瘤細(xì)胞中過量的8-OHdG，從而參與DNA損傷修復(fù)過程，使得腫瘤細(xì)胞繼續(xù)分裂與增殖，維持腫瘤細(xì)胞的生存?，F(xiàn)在已經(jīng)有報道在一些人類癌癥如腎癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌中MTH1的表達(dá)增加。另外，也有報道證實(shí)與相鄰的非癌組織相比，MTH1在肝癌組織中明顯增加。然而，其在肝癌發(fā)生中的確切作用還不是很清楚。我們試圖研究HS-1200抑制肝癌發(fā)生的潛在能力，并探討MTH1參與肝癌發(fā)生的作用。鑒于此，我們

7、建立了通過腹腔注射二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)誘導(dǎo)產(chǎn)生大鼠原發(fā)性肝癌的動物模型，我們以不同劑量的HS-1200干預(yù)此模型，來觀察HS-1200對于模型大鼠肝功能和肝癌發(fā)生的作用，并研究大鼠肝組織MTH1mRNA的水平，從而探討HS-1200的抗腫瘤活性。
　　研究方法:
　　實(shí)驗(yàn)共需145只雄性Wistar鼠，其中50只大鼠用于確定HS-1200潛在的肝毒性和腎毒性，20只用于通過腹腔內(nèi)注射D

8、EN進(jìn)行DEN誘導(dǎo)的原發(fā)性肝癌的實(shí)驗(yàn)性造模。在進(jìn)行了HS-1200的安全性無毒評估和大鼠肝癌模型成功建模之后，其它75只大鼠進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):大鼠隨機(jī)分為5組:對照組(N=15)，HS-1200組(N=15)，HCC（肝細(xì)胞癌）組(N=15)，HCC+低劑量HS-1200組(N=15)和HCC+高劑量HS-1200(N=15)組。后三組按照實(shí)驗(yàn)造模條件腹腔內(nèi)注射DEN建立大鼠肝癌模型，同時后四組通過每日口服灌胃法對大鼠進(jìn)行不同劑量HS-12

9、00的藥物干預(yù)。20周后，處死大鼠，稱大鼠體重，取其肝臟稱重，計算肝重/體重比（肝系數(shù)）及結(jié)節(jié)計數(shù)，并進(jìn)行病理學(xué)檢驗(yàn)。大鼠心臟采血用ELISA法檢測血清中AFP、ALT、AST的水平。取各組大鼠的肝組織，分別提取RNA，應(yīng)用實(shí)時熒光定量RT-PCR法檢測各組大鼠肝組織中MTH1mRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.20周末時HCC組、HCC+低劑量HS-1200組和HCC+高劑量HS-1200組均成功建立大鼠原發(fā)性肝癌模

10、型，各組的成瘤率分別為93％(14/15)、73％(11/15)、53％(8/15)。對照組和HS-1200組大鼠的體重、肝重及肝臟系數(shù)無明顯差異，HCC組、HCC+低劑量HS-1200組和HCC+高劑量HS-1200組大鼠的體重均明顯低于對照組(P＜0.05);但與HCC組相比，動物接受低劑量或高劑量HS-1200治療后顯示其體重增加，肝臟重量和肝系數(shù)降低了(P＜0.05);且HCC+高劑量HS-1200組大鼠的體重較HCC+低劑量H

11、S-1200組明顯升高，肝重和肝臟系數(shù)明顯降低(P＜0.05)。
　　2.對照組和HS-1200組的大鼠肝臟均正常未見結(jié)節(jié)。HE肝臟病理形態(tài)學(xué)觀察顯示對照組和HS-1200組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，無變性和壞死現(xiàn)象;HCC組正常肝小葉組織結(jié)構(gòu)消失，假小葉形成，肝細(xì)胞索排列紊亂，可見癌巢，腫瘤細(xì)胞異型性明顯，可見大片狀壞死;在應(yīng)用HS-1200干預(yù)之后，癌巢形成和出血壞死減少了，肝臟病理有了明顯改善，HCC+低劑量HS-1200組正常肝小葉

12、結(jié)構(gòu)消失，可見假小葉結(jié)構(gòu)，偶見癌巢及出血壞死;HCC+高劑量HS-1200組肝臟病理改善更顯著，僅偶見假小葉，無明顯癌巢，出血壞死少見。
　　3.與對照組相比，HCC組大鼠血清中ALT、AST和AFP的含量明顯升高(P＜0.05與對照組比較)，這意味著肝功能的惡化;而HS-1200干預(yù)之后，各項(xiàng)指標(biāo)的升高得到了不同程度的逆轉(zhuǎn)，較HCC組均有所降低（P＜0.05與HCC組比較）;且HS-1200高劑量組各項(xiàng)指標(biāo)的降低更明顯。

13、　　4.以正常對照組大鼠肝臟MTH1mRNA的表達(dá)水平1為參照，HCC組的相對表達(dá)量為16.23±0.74(P＜0.05)。應(yīng)用HS-1200治療顯著逆轉(zhuǎn)MTH1 mRNA的上調(diào)表達(dá)，高劑量HS-1200似乎在這方面有更高的功效(HCC+低劑量HS-1200組，9.48±0.46;HCC+高劑量HS-1200組，6.13±0.33; P＜0.05與HCC組比較)。
　　結(jié)論:
　　1.HS-1200無明顯肝、腎毒性，保證了此

14、藥物的安全性。DEN腹腔注射可以成功建立大鼠原發(fā)性肝癌模型。
　　2.HS-1200可降低DEN誘導(dǎo)的大鼠肝臟瘤變率，并降低大鼠血清中AFP含量，說明HS-1200對大鼠原發(fā)性肝癌的發(fā)生具有抑制作用。
　　3.HS-1200可降低大鼠血清中AST、ALT的水平，可降低大鼠肝臟中MTH1mRNA的表達(dá)，說明HS-1200對大鼠原發(fā)性肝癌發(fā)生的抑制作用與其改善大鼠肝功能抑制炎癥、抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。
　　第二部分:鵝去氧膽酸

15、衍生物HS-1200抑制HepG2裸鼠肝癌移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究
　　研究目的:
　　為了進(jìn)一步研究HS-1200對肝癌腫瘤血管生成及轉(zhuǎn)移性肝癌的作用，我們通過瘤體接種BALB/C裸鼠，復(fù)制了人肝癌細(xì)胞株HepG2裸鼠皮下移植瘤模型，觀察HS-1200干預(yù)對移植瘤組織結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)及新生血管生成的影響。以發(fā)現(xiàn)HS-1200對于肝癌腫瘤血管生成因子VEGF、bFGF表達(dá)及血管生成的作用，從而為HS-1200應(yīng)用于臨床肝癌及轉(zhuǎn)移的治療

16、進(jìn)一步積累實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法:
　　人肝癌細(xì)胞株HepG2調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×107/ml，將細(xì)胞懸液接種于裸鼠腋窩皮下。皮下成瘤至長徑約10mm時，剝離瘤體，取離體瘤組織以每個大小2×2×2mm3接種于60余只裸鼠左側(cè)腋窩皮下。待接種瘤體長至長徑約10mm，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分對照組(N=20)、20mg/kg低劑量HS-1200組(N=20)、60 mg/kg高劑量HS-1200組(N=20)。后兩組分別腹腔注射相對

17、應(yīng)的劑量的HS-1200，每天一次，對照組裸鼠以相同方式給予等量滅菌注射用水處理，共2周。之后處死裸鼠并剝離移植瘤，測量并稱重移植瘤，計算瘤體積，計算低、高劑量HS-1200治療組瘤重的抑瘤率。光鏡和電鏡觀察各組移植瘤組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)，免疫組織化學(xué)法檢測各組移植瘤VEGF、bFGF表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.低、高劑量HS-1200組移植瘤體積、重量均明顯小于對照組，抑瘤率分別為38.23％、47.05％。
　　2.

18、光鏡觀察，對照組見血管增生活躍，瘤細(xì)胞內(nèi)癌巢分布，細(xì)胞呈明顯異型性。HS-1200干預(yù)組移植瘤見血管數(shù)量稀少或缺如，癌巢明顯減少，HS-1200高劑量組更明顯。
　　3.透射電鏡觀察，對照組呈現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)怪異，核大畸形等惡性腫瘤特有的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn);低、高劑量HS-1200組移植瘤組織見不同時期凋亡細(xì)胞，凋亡小體存在，壞死瘤細(xì)胞及細(xì)胞崩解碎片可見，且HS-1200高劑量組更明顯。
　　4.免疫組化結(jié)果表明，低、高劑量HS-120

19、0組移植瘤中VEGF、bFGF陽性表達(dá)比對照組明顯下調(diào)(p＜0.05)，且HS-1200高劑量組更明顯。
　　結(jié)論:
　　1.HS-1200可抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2裸鼠皮下移植瘤生長。
　　2.HS-1200干預(yù)使移植瘤血供明顯減少，提示HS-1200可抑制移植瘤新生血管生成。
　　3.對比移植瘤超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，證明HS-1200干預(yù)可誘導(dǎo)移植瘤細(xì)胞凋亡。
　　4.根據(jù)免疫組化結(jié)果，推測HS-1200下調(diào)