鵝脫氧膽酸衍生物HS-1200阻抑肝癌的實驗研究.pdf

1、研究背景與目的： 原發(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，目前肝癌的治療仍以手術切除為首選的治療方法，但手術切除的突出問題是手術后復發(fā)率高，手術切除機會少，加上絕大多數(shù)患者在確診時已屬臨床中晚期，從而失去了手術治療的最佳時機。因此，科技工作者不斷研究一些新的療法，或者采取多種療法聯(lián)合的綜合治療來提高肝癌的總體療效。在各種治療方法中，肝癌的化療在肝癌的治療中占有重要地位。雖然肝癌不屬于化療敏感的惡性腫瘤，但由于化療途徑和化療方案的改

2、進，肝癌化療的療效有了明顯的提高，成為肝癌綜合治療中的重要手段。因而研究和發(fā)現(xiàn)新的、有效的治療肝癌藥物是當務之急。 膽汁酸是膽固醇的極性衍生物，主要有助于飲食中脂質(zhì)的吸收，并能調(diào)節(jié)控制膽固醇體內(nèi)平衡的相關基因的表達。由于化學結構的不同，不同膽汁酸表現(xiàn)為不同的生物學特性，鵝脫氧膽酸為一種初級膽汁酸，可用來治療膽石癥并能控制血液中膽固醇濃度。近來研究表明鵝脫氧膽酸衍生物N-((3 α，5 β，7α )-3,7-二羥基-24-氧代膽甾

3、烷－24－基)　β－丙氨酸芐酯和N-((3α，5 β，7α )-3,7-二羥基－24－氧代膽甾烷-24－基)L－苯丙氨酸芐酯(HS－1199)能誘導多種癌細胞凋亡并能抑制其增殖，如人乳腺癌細胞、人子宮頸癌細胞，人前列腺癌細胞及人骨肉瘤細胞等，而以HS－1200作用更強。但還沒有關于HS－1200對肝腫瘤細胞的作用及機制的報道，在該實驗中，我們探討鵝脫氧膽酸衍生物HS－1200誘導肝腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤細胞活性方面的作用及機制；并進一步

4、用肝腫瘤細胞株BEL7402建立裸鼠人肝癌移植瘤模型，用HS－1200對荷瘤裸鼠進行干預，并進一步研究該藥物治療肝移植瘤的作用及作用機制。 方法： 1、培養(yǎng)肝腫瘤細胞株BEL7402及正常人肝細胞株L－02，分別用不同濃度的鵝脫氧膽酸衍生物HS-1200處理上述兩種細胞后，采用四氮唑藍法檢測鵝脫氧膽酸衍生物HS-1200對BEL7402及L-02細胞的細胞活性抑制作用；以DNA凝膠電泳法、流式細胞術檢測HS-1200誘導

5、細胞凋亡的作用并對細胞凋亡進行量化；通過Hoechst33258染色熒光顯微鏡下觀察經(jīng)HS-1200處理后細胞形態(tài)的改變；為進一步研究HS-1200誘導肝腫瘤細胞株凋亡的機制，我們應用Western-blot檢測Bcl-2、Bax、cytochrome c、caspase-3、caspase-8、caspase-9及PARP的表達；為研究caspase-8及caspase-9在HS-1200誘導肝腫瘤細胞凋亡中的作用，應用caspase

6、-8特異性抑制劑z-IETDfmk及caspase-9的特異性抑制劑z-LEHDfmk來阻斷caspase-8及caspase-9的活性，驗證caspase-8及caspase-9在HS-1200誘導肝腫瘤細胞凋亡中的作用；大量的研究表明線粒體與細胞凋亡密切相關，其中線粒體跨膜電位的破壞，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中最早發(fā)生的事件之一，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉，我們通過檢測線粒體跨膜電位的變化來驗證線粒體在HS-12

7、00誘導肝腫瘤細胞凋亡中的作用。 2、荷瘤裸鼠動物模型的構建及鵝脫氧膽酸衍生物HS-1200對動物模型的干預： BEL7402細胞培養(yǎng)于37℃、5％CO2的孵箱內(nèi)，培養(yǎng)基為含有10％FBS的DMEM，以0.25％的胰酶消化傳代，制備單細胞懸液，以臺盼蘭染色法計數(shù)活細胞，調(diào)整細胞密度為5×106/ml，無菌條件下接種至裸鼠的左肋部皮下，每個裸鼠接種部位一致且都接種0.2ml，接種后裸鼠在無菌、恒溫、恒濕的條件下飼養(yǎng)，待裸鼠肝移植瘤

8、生長至直徑5mm左右時，采用隨機數(shù)字法將裸鼠分為A、B、C、D 4組，采用腹腔注射的方法給藥，分別注射0.2ml生理鹽水(A組)，20mg/kgHS-1200(B組)，40mg/kg HS-1200(C組)，60mg/kg HS-1200(D組)，每日給藥1次，共5次。測量腫瘤的體積，繪制各組腫瘤的生長曲線，計算抑瘤率，實驗結束后處死動物，對移植瘤組織進行HE染色，光鏡下觀察瘤組織的形態(tài)學改變，TUNEL法檢測移植瘤組織細胞的凋亡率，免

9、疫組化法檢測移植瘤組織內(nèi)PCNA的表達情況，通過移植瘤組織內(nèi)PCNA陽性細胞百分數(shù)來判斷不同劑量HS-1200的抑瘤效果，應用Western-blot檢測Bcl-2、Bax、cytochrome c、cleaved-caspase-3、pro-caspase-8、cleaved-caspase-9及Apaf-1的表達，進一步探討HS-1200的抑瘤作用機制。 結果： 1、HS-1200 MTT檢測結果顯示鵝脫氧膽酸衍生物

10、HS-1200可有效地抑制肝腫瘤細胞株BEL7402的活性，其作用隨藥物濃度提高和作用時間延長而增強，呈現(xiàn)一定的劑量、時間依賴性：HS-1200 40μM作用于BEL7402細胞24h、48h、72h的生長抑制率分別為(29.25±0.54)％、(38.54±1.28)％、(50.29±1.81)％，HS-1200 80μM作用于BEL7402細胞24h、48h、72h的生長抑制率分別為(55.26±1.37)％、(62.49±1.42

11、)％、(71.34±2.04)％，同一細胞株不同濃度及不同時間之間的生長抑制率差異有顯著性(P＜0.05)。FCM凋亡檢測結果表明，BEL7402細胞經(jīng)HS-1200 40μM、60μM、80μM 3個濃度作用24h的凋亡率分別為(11.42±0.54.)％、(21.36±0.28)％、(42.25±0.52)％，對照組的凋亡率為(1.09±0.05)％；BEL7402細胞經(jīng)601μMHS-1200分別作用24h、48h、72h的凋亡率

12、分別為(21.36±0.28)％、(29.82±0.31)％、(37.15±0.45)％，隨作用濃度和作用時間的延長，凋亡率顯著增加，實驗組與對照組之間及不同濃度組之間，有顯著性差異(P＜0.05)；Hoechst33258染色結果顯示細胞凋亡的形態(tài)學改變，凝膠電泳顯示典型的凋亡梯形條帶，Western blot檢測結果為HS-1200提升Bax、細胞色素C、PARP、cleaved-casepase-9及cleaved-caspase

13、-3的表達，而降低Bcl-2的蛋白表達水平，HS-1200能明顯降低肝腫瘤細胞的線粒體膜電位。 2、經(jīng)HS-1200治療的裸鼠肝移植瘤，觀察分離出的移植瘤的體積就可發(fā)現(xiàn)，治療組移植瘤體積明顯小于對照組移植瘤體積，并且在治療組中隨HS-1200濃度增高，腫瘤體積逐漸變??；根據(jù)腫瘤生長曲線可以發(fā)現(xiàn)，HS-1200治療后的腫瘤生長曲線不再表現(xiàn)為對照組的指數(shù)生長曲線，表現(xiàn)為增長緩慢，隨著濃度增高，其抑制作用逐漸增強，生長逐漸減慢；HE染

14、色后發(fā)現(xiàn)各組腫瘤組織內(nèi)均有不同程度的壞死，對照組多以輕度壞死為主，而治療組經(jīng)藥物治療后壞死面積均增加，大劑量組(60mg/kg)可見大片壞死組織，瘤細胞占切片的小部分；腫瘤組織的凋亡實驗結果表明，各處理組隨著濃度增高，腫瘤組織中的凋亡細胞明顯增多，各組的凋亡指數(shù)分別為：對照組為(4.6±1.6)％；HS-1200(20mg/kg)組為(9.3±2.1)％；HS-1200(40mg/kg)組為(13.3±3.2)％；HS-1200(60m

15、g/kg)組為(17.5±4.3)％；各處理組同對照組比較P＜0.05：PCNA檢測結果為：對照組滿視野細胞核呈棕黃色的陽性腫瘤細胞，細胞形態(tài)極不規(guī)則，而HS-1200處理組則可見上述現(xiàn)象逐漸減少，并且視野中出現(xiàn)較多細胞核、細胞質(zhì)均為淡藍色的細胞。尤其HS-1200(60mg/kg)高劑量組，滿視野細胞核、細胞質(zhì)均為淡藍色，細胞形態(tài)較為規(guī)則，HS-1200(60mg/kg)高劑量組的陽性細胞百分數(shù)為：(9.7±1.5)％；HS-1200

16、(40mg/kg)中劑量組陽性細胞百分數(shù)： (14.7±2.0)％；HS-1200(20mg/kg)低劑量組陽性細胞百分數(shù)：(18.9±2.7)％；對照組陽性細胞百分數(shù)： (22.5±3.6)％；Western blot檢測結果為HS-1200提升Bax、細胞色素C、Apaf-1、cleaved-casepase-9及cleaved-caspase-3的表達，降低Bcl-2的蛋白表達水平。 結論： 1.鵝脫氧膽酸衍生物H

17、S-1200對人肝腫瘤細胞株BEL7402有顯著的生長抑制作用，該生長抑制作用與HS-1200誘導肝腫瘤細胞凋亡有關；HS-1200對正常肝細胞株無生長抑制及誘導凋亡的作用。 2.HS-1200誘導凋亡的機制可能與HS-1200降低肝腫瘤細胞的線粒體膜電位及提升Bax而降低Bcl-2的表達，從而使線粒體膜通透性增高，使細胞色素C由線粒體釋放入胞漿，活化caspase-9，活化的caspase-9切割pro-caspase-3生成

18、活性caspase-3，從而誘導凋亡；但上述凋亡過程中caspase-8特異性抑制劑未改變HS-1200誘導的凋亡，因而HS-1200誘導肝腫瘤細胞凋亡途徑為內(nèi)源性凋亡途徑。 3.采用人肝腫瘤細胞株BEL7402建立的裸鼠人肝移植瘤模型，用HS-1200進行治療后可抑制裸鼠肝移植瘤的生長，引起瘤組織內(nèi)腫瘤細胞的凋亡和組織壞死。HS-1200抑瘤作用與其誘導肝腫瘤細胞凋亡有關，凋亡途徑亦為內(nèi)源性凋亡途徑。 4.鵝脫氧膽酸衍