澳洲茄邊堿通過PGE2-EP4及其下游DNMT1-c-Jun調(diào)控肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制.pdf

1、目的:
　　澳洲茄邊堿屬于扶正抗癌方中龍葵的生物堿成分，文獻(xiàn)報(bào)道扶正抗癌方治療肺癌有良好的效果，隨著相關(guān)研究的深入，對(duì)扶正抗癌方內(nèi)的單味中藥所含的單體成份的研究也逐漸開展?，F(xiàn)有研究報(bào)道，龍葵以及澳洲茄邊堿對(duì)于多種腫瘤均有較明顯的抑制作用，但相關(guān)的作用機(jī)理報(bào)道較少。通過前期實(shí)驗(yàn)研究，我們發(fā)現(xiàn)澳洲茄邊堿對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)有良好的抑制作用。我們?cè)O(shè)置此課題，通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明澳洲茄邊堿抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)可能的分子機(jī)制。

2、　　方法:
　　采用四甲基偶氮甲唑鹽比色(MTT)方法檢測(cè)澳洲茄邊堿對(duì)肺癌細(xì)胞(A549、H1299、H1299、H1650、H1975)的生長(zhǎng)的抑制作用，比較不同濃度澳洲茄邊堿對(duì)肺癌A549、H1299細(xì)胞在24h，48h和72h的細(xì)胞活力的影響。采用流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)澳洲茄邊堿作用48h后對(duì)A549和H1299肺癌細(xì)胞周期的影響。
　　利用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot，WB

3、)檢測(cè)澳洲茄邊堿(6.0μ M)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)A549和H1299肺癌細(xì)胞Akt、ERK等激酶蛋白磷酸化的表達(dá)的影響。利用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)不同濃度梯度澳洲茄邊堿作用于A549和H1299肺癌細(xì)胞24小時(shí)后SP1、EP4、NF-κ B、DNMT1、c-Jun等蛋白表達(dá)情況。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)澳洲茄邊堿(6.0μ M)對(duì)A549和H1299肺癌細(xì)胞EP4 mRNA表達(dá)水平的影響;采用雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)澳洲

4、茄邊堿對(duì)A549和H1299肺癌細(xì)胞EP4啟動(dòng)子活性的影響;采用ERK抑制劑(PD98059)，觀察澳洲茄邊堿通過p-ERK對(duì)DNMT1蛋白表達(dá)的影響。采用外源性過表達(dá)（質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）技術(shù)研究澳洲茄邊堿作用后，觀察相關(guān)蛋白表達(dá)的相互影響。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用A549-Luc細(xì)胞接種裸鼠腋下形成移植瘤模型。采用隨機(jī)數(shù)字法分組，分為:空白對(duì)照組、澳洲茄邊堿低劑量組(4mg/kg)、澳洲茄邊堿高劑量組(8mg/kg)。隔天一次腹腔注射給藥，用

5、藥30天。采用小動(dòng)物活體成像技術(shù)觀察比較，澳洲茄邊堿低劑量和高劑量處理后裸鼠瘤體生物熒光信號(hào)與對(duì)照組的差異。觀察比較處理前后瘤體體積、瘤體重量與對(duì)照組的變化。提取瘤體組織蛋白，采用Western Blot法觀察高劑量澳洲茄邊堿處理后裸鼠瘤體組織相關(guān)蛋白EP4、DNMT1、c-Jun、p-ERK與對(duì)照組比較蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　本研究分別從體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了澳洲茄邊堿對(duì)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，及其可能的分子

6、機(jī)制。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，四甲基偶氮甲唑鹽比色(MTT)方法證實(shí)澳洲茄邊堿對(duì)多株肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，同時(shí)證實(shí)澳洲茄邊堿對(duì)肺癌A549和H1299細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制隨著用藥劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)作用越明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)證實(shí)澳洲茄邊堿對(duì)肺腺癌A549、H1299細(xì)胞的細(xì)胞周期可阻滯在G0/G1期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)果顯示，澳洲茄邊堿對(duì)Akt的磷酸化具有抑制作

7、用，對(duì)SP1、NF-κ B(p65)、EP4蛋白的表達(dá)具有抑制作用，其隨著劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)作用越明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　外源性過表達(dá)Akt可以阻滯澳洲茄邊堿對(duì)SP1蛋白表達(dá)的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);外源性過表達(dá)SP1對(duì)澳洲茄邊堿阻滯p-Akt蛋白表達(dá)無明顯作用，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。外源性過表達(dá)SP1可以阻滯澳洲茄邊堿對(duì)p65蛋白表達(dá)的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

8、p＜0.05);外源性過表達(dá)p65對(duì)澳洲茄邊堿阻滯SP1蛋白表達(dá)無明顯作用，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。外源性過表達(dá)p65可以阻滯澳洲茄邊堿對(duì)EP4蛋白表達(dá)的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。外源性過表達(dá)EP4對(duì)澳洲茄邊堿阻滯SP1、p65蛋白表達(dá)無明顯作用，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。過表達(dá)EP4對(duì)澳洲茄邊堿阻滯p-Akt蛋白的表達(dá)具有陽性負(fù)反饋?zhàn)饔谩Ｍ瑫r(shí)，熒光定量PCR(qRT-PCR)法和雙熒光素酶報(bào)

9、告基因法證明澳洲茄邊堿(6.0μM)可以降低A549和H1299肺癌細(xì)胞EP4 mRNA水平以及降低EP4啟動(dòng)子活性。
　　結(jié)果顯示，澳洲茄邊堿對(duì)ERK的磷酸化具有促進(jìn)作用，對(duì)DNMT1、c-Jun蛋白的表達(dá)具有抑制作用，其隨著劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)作用越明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　外源性過表達(dá)EP4可以阻滯澳洲茄邊堿對(duì)c-Jun蛋白表達(dá)的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);外源性過表達(dá)c-Ju

10、n對(duì)澳洲茄邊堿阻滯EP4蛋白表達(dá)無明顯作用，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。外源性過表達(dá)EP4可以阻滯澳洲茄邊堿對(duì)p-ERK蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。ERK抑制劑PD98059可以阻滯澳洲茄邊堿對(duì)DNMT1蛋白表達(dá)的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。外源性過表達(dá)DNMT1可以阻滯澳洲茄邊堿對(duì)c-Jun蛋白表達(dá)的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。外源性過表達(dá)c-Jun對(duì)澳洲茄邊堿阻滯D

11、NMT1蛋白表達(dá)無明顯作用，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。過表達(dá)c-Jun對(duì)澳洲茄邊堿促進(jìn)p-ERK蛋白的表達(dá)具有陽性負(fù)反饋?zhàn)饔谩?br>　　在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，澳洲茄邊堿對(duì)移植瘤瘤體的體積增長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。澳洲茄邊堿低劑量組(4mg/kg)與高劑量組(8mg/kg)瘤體與對(duì)照組比較，移植瘤瘤體的生物熒光信號(hào)值都有明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。瘤體的重量偏輕，體積偏小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)

12、第15、20、30天，澳洲茄邊堿高劑量組與低劑量組瘤體體積較對(duì)照明顯偏小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。在第20、30天，澳洲茄邊堿高劑量組與澳洲茄邊堿低劑量組比較，高劑量組瘤體體積有明顯偏小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。說明澳洲茄邊堿對(duì)移植瘤瘤體的體積增長(zhǎng)有抑制作用，且隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)與對(duì)照組的差異越明顯。采用WesternBlot技術(shù)檢測(cè)瘤體組織相關(guān)蛋白的表達(dá)顯示體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)相關(guān)蛋白表達(dá)的變化趨勢(shì)一致:與空

13、白對(duì)照組相比，澳洲茄邊堿高劑量組ERK的磷酸化水平升高，與空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。澳洲茄邊堿高劑量組可以降低EP4、c-Jun和DNMT1蛋白的表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　本研究分別從體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了澳洲茄邊堿對(duì)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，澳洲茄邊堿對(duì)肺腺癌A549、H1299細(xì)胞的細(xì)胞活力具有抑制作用，且成劑量以及時(shí)間依賴關(guān)系，隨著澳洲

14、茄邊堿劑量的增大以及給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，澳洲茄邊堿對(duì)肺腺癌A549、H1299細(xì)胞的細(xì)胞活力的抑制作用越明顯。證明澳洲茄邊堿對(duì)肺腺癌A549、H1299細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響，對(duì)兩株細(xì)胞的細(xì)胞周期均可阻滯在G0/G1期。證實(shí)澳洲茄邊堿可能通過PI3k/Akt通路，抑制核轉(zhuǎn)錄因子SP1以及NF-κ B(p65)蛋白的表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平抑制EP4的表達(dá)。通過對(duì)EP4蛋白表達(dá)的抑制，阻滯肺腺癌A549、H1299細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示EP4在澳

15、洲茄邊堿調(diào)節(jié)肺腺癌細(xì)胞增殖過程中起著重要作用。我們進(jìn)一步對(duì)EP4的下游通路作深入研究，發(fā)現(xiàn)EP4可以通過對(duì)p-ERK的調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響DNMT1以及c-Jun的表達(dá)，同時(shí)證明c-Jun蛋白在澳洲茄邊堿抑制肺腺癌A549、H1299細(xì)胞增殖中的重要作用。
　　在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，澳洲茄邊堿對(duì)移植瘤瘤體的體積增長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。與對(duì)照組比較，澳洲茄邊堿低劑量組與高劑量組瘤體的重量偏輕，體積偏小。同時(shí)，本次試驗(yàn)中澳洲茄邊堿高劑量組與低劑量組

16、比較，高劑量組抑制作用更明顯。澳洲茄邊堿對(duì)移植瘤瘤體的增殖隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，與對(duì)照組差別越明顯。
　　在體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，澳洲茄邊堿對(duì)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。本研究提示，EP4蛋白及其下游c-Jun蛋白在澳洲茄邊堿抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的過程中起到重要作用，EP4蛋白及其下游c-Jun蛋白的表達(dá)的變化對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有調(diào)節(jié)作用。
　　綜上所述，本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)相關(guān)蛋白表達(dá)的變化結(jié)果一致，進(jìn)一步肯定了澳洲茄邊