胃癌細(xì)胞中DNMT3A2對E-cadherin表達(dá)表觀調(diào)控機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的:探討胃癌中DNMT3A2調(diào)控E-cadherin表達(dá)的表觀調(diào)控機(jī)制。
　　方法:采用RT-qPCR方法檢測E-cadherin在胃癌組織病例中的表達(dá)模式，并統(tǒng)計(jì)分析E-cadherin的差異表達(dá)與DNMT3A2在胃癌組織病例中表達(dá)的相關(guān)性。TGF-β持續(xù)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞使細(xì)胞出現(xiàn)EMT表型，應(yīng)用RT-qPCR方法檢測細(xì)胞中DNMT3A2的表達(dá)，同時(shí)應(yīng)用Western Blot檢測E-cadherin蛋白的表達(dá)。構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)和穩(wěn)

2、定干擾DNMT3A2的胃癌細(xì)胞系，分別在穩(wěn)定過表達(dá)和干擾DNMT3A2的細(xì)胞中檢測E-cadherin的表達(dá)。IP實(shí)驗(yàn)分析并驗(yàn)證DNMT3A2與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2、G9a的結(jié)合關(guān)系，應(yīng)用RT-qPCR分析穩(wěn)定過表達(dá)DNMT3A2的細(xì)胞中瞬時(shí)干擾EZH2、G9a以及SUV39H1后E-cadherin的表達(dá)變化。設(shè)計(jì)兩條抑制Snail基因的小干擾RNA，在穩(wěn)定過表達(dá)DNMT3A2的胃癌細(xì)胞中瞬時(shí)干擾Snail基因，RT-qPCR檢測

3、E-cadherin的表達(dá)水平。應(yīng)用全基因組甲基化測序技術(shù)檢測干擾DNMT3A2后對全基因組甲基化水平的影響。
　　結(jié)果:1）在34例胃癌病例中分析E-cadherin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在胃癌組織病例中呈現(xiàn)低表達(dá)模式，低表達(dá)率達(dá)54％。統(tǒng)計(jì)分析DNMT3A2與E-cadherin在胃癌組織病例中表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示在DNMT3A2高表達(dá)組中，E-cadherin的平均表達(dá)量低;而在DNMT3A2低表達(dá)組中E-cadherin的平均表

4、達(dá)量高。兩者的表達(dá)水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)趨勢。
　　2) TGF-β誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MKN45和BGC823后，細(xì)胞發(fā)生明顯的EMT表型，即細(xì)胞形態(tài)由上皮樣向間質(zhì)樣轉(zhuǎn)變。分別應(yīng)用RT-qPCR和Western Blot檢測DNMT3A2和E-cadherin的表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞發(fā)生EMT后，DNMT3 A2表達(dá)上調(diào)與此同時(shí)E-cadherin表達(dá)下調(diào)。
　　3)構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)和穩(wěn)定干擾DNMT3A2的胃癌細(xì)胞系，分別在穩(wěn)定過表達(dá)和干擾D

5、NMT3A2的細(xì)胞中檢測E-cadherin的表達(dá)，當(dāng)DNMT3A2過表達(dá)時(shí)，E-cadherin與對照相比表達(dá)下調(diào);反之在DNMT3A2低表達(dá)的細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)上調(diào)。
　　4)IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DNMT3A2與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2、G9a存在直接相互作用，在過表達(dá)DNMT3A2的胃癌細(xì)胞系中瞬時(shí)干擾組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2、G9a以及SUV39H1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在這三個(gè)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)被抑制后，E-cadherin

6、的表達(dá)有所恢復(fù)，證明DNMT3A2可以協(xié)調(diào)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶共同調(diào)控E-cadherin的表達(dá)。
　　5)在過表達(dá)DNMT3A2的胃癌細(xì)胞中瞬時(shí)干擾Snail，E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，說明Snail對E-cadherin的表達(dá)也起到調(diào)控作用。
　　6)在穩(wěn)定干擾DNMTA2的胃癌細(xì)胞以及對照細(xì)胞中檢測全基因組甲基化水平，結(jié)果顯示干擾DNMT3A2后，全基因組甲基化水平降低，與癌癥有關(guān)的信號(hào)通路受到影響，且會(huì)影響E-ca

7、dherin的表達(dá)。
　　結(jié)論:根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)及研究結(jié)果，本研究得到以下結(jié)論，
　　1.E-cadherin在胃癌組織病例中呈現(xiàn)低表達(dá)模式，且E-cadherin的表達(dá)水平與DNMT3A2的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。
　　2.DNMT3A2在胃癌細(xì)胞中可以抑制E-cadherin的表達(dá)。
　　3.DNMT3A2可以協(xié)同組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2、G9a以及SUV39H1共同調(diào)控DNMT3A2的表達(dá)。
　　4.Snail