E-cadherin和α-SMA基因的表觀調(diào)控在腎間質(zhì)纖維化中作用的研究.pdf

1、目的:采用焦磷酸測序技術(shù)對大鼠腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程中E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)進(jìn)行定位、定量檢測,分別比較腎小管上皮細(xì)胞在表型轉(zhuǎn)化前后E-cadherin基因以及α-SMA基因的甲基化狀態(tài)及數(shù)量差異,以期揭示表觀遺傳學(xué)在腎小管上皮細(xì)胞EMT

2、過程中的作用,有助于進(jìn)一步闡明腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,進(jìn)而為臨床上慢性腎病的早期防治提供新的方向。
　　方法:將體外培養(yǎng)的NRK細(xì)胞株隨機(jī)分為兩組:①正常對照組;②TGF-β1干預(yù)組(10ng/ml)。兩組細(xì)胞干預(yù)培養(yǎng)48h后,觀察NRK細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化,細(xì)胞免疫化學(xué)染色半定量檢測貼壁細(xì)胞中E-cadherin以及α-SMA蛋白表達(dá)量,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISAs)檢測兩組細(xì)胞上清液中Ⅰ型膠原蛋白的濃度,提取收集細(xì)胞中的基因

3、組 DNA,應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)分別對兩組細(xì)胞中E-cadherin和α-SMA基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平進(jìn)行檢測。分析比較NRK細(xì)胞誘導(dǎo)前后兩種基因特定區(qū)域甲基化狀態(tài)變化。
　　結(jié)果:1)培養(yǎng)48h后,正常對照組的NRK細(xì)胞形態(tài)仍為橢圓形的鋪路磚樣,而TGF-β1干預(yù)組中NRK細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變,由橢圓形的鋪路磚樣的上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài);2)培養(yǎng)48h后,正常組NRK細(xì)胞胞漿中上皮標(biāo)志性蛋白E-cadherin

4、呈高表達(dá),TGF-β1干預(yù)組細(xì)胞胞漿內(nèi)無 E-cadherin表達(dá)(P<0.001);正常組NRK細(xì)胞胞漿中無間質(zhì)源性標(biāo)志性蛋白α-SMA表達(dá),TGF-β1干預(yù)組細(xì)胞胞漿內(nèi)α-SMA的表達(dá)顯著增加(P<0.001)。3)與正常對照組相比,培養(yǎng)48h后,TGF-β1干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的I型膠原蛋白含量顯著增加(P<0.001)。4)經(jīng)焦磷酸測序的定位、定量檢測兩組細(xì)胞E-cadherin基因目的片段上的8個(gè)CpG位點(diǎn)以及α-SMA基因

5、目的片段上的6個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài),可發(fā)現(xiàn),TGF-β1干預(yù)組細(xì)胞中E-cadherin基因甲基化頻率高于正?？瞻捉M(P<0.001);TGF-β1干預(yù)組細(xì)胞中α-SMA基因甲基化頻率低于正常對照組(P<0.001)。
　　結(jié)論:1)經(jīng)10ng/ml的TGF-β1干預(yù)NRK細(xì)胞48h后可迅速建立理想的腎小管上皮細(xì)胞EMT和腎間質(zhì)纖維化體外模型;2)E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū) CpG島高甲基化狀態(tài)導(dǎo)致基因失活,使上皮標(biāo)志物