肺癌胸水腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)、鑒定及其對常規(guī)化療藥物敏感性研究.pdf

1、背景：
　　肺癌是全球范圍內(nèi)威脅人類生存的一大健康問題。在我國，男性患者中肺癌發(fā)病率居于所有癌癥的首位；女性患者中，僅次于乳腺癌居第2位[1]。同時(shí)，肺癌患者的死亡率居高不下，據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，截至到2030年，全球每年將會(huì)有約250萬人死于肺癌。造成肺癌高死亡率的主要原因之一是一半以上的肺癌患者診斷時(shí)已是晚期（ⅢB期-Ⅳ期），此時(shí)，可供選擇的治療方案只有全身性化療和有限的靶向治療及免疫治療[2]。然而，在全身化療的情況下，肺癌

2、患者的五年生存率仍低于15％。這種低存活率現(xiàn)象的原因之一是因?yàn)槟[瘤患者對化療藥物的敏感性不同造成的。在化療前或化療中缺乏可靠的指標(biāo)指導(dǎo)臨床醫(yī)師選擇最優(yōu)的化療藥物[3]，仍是目前肺癌治療亟待解決的問題。因此，研究一個(gè)個(gè)體化、能充分體現(xiàn)患者個(gè)體特征進(jìn)而指導(dǎo)臨床化療的手段成為一種必需。
　　原代細(xì)胞培養(yǎng)是直接從機(jī)體獲取細(xì)胞、組織或器官進(jìn)行體外培養(yǎng)。相對于一般研究所采用的成熟細(xì)胞系來說，原代培養(yǎng)的細(xì)胞可以更真實(shí)的反應(yīng)機(jī)體的特征、更能代表患

3、者的生物學(xué)和臨床特性[4-6]。傳統(tǒng)的肺癌原代培養(yǎng)是通過手術(shù)獲取組織標(biāo)本，采用酶消化法或組織塊培養(yǎng)發(fā)進(jìn)行原代培養(yǎng)[7-10]。然而多數(shù)肺癌患者診斷是已處于肺癌晚期，失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，因此原代培養(yǎng)的組織標(biāo)本獲取受到限制。同時(shí)，組織來源的細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的生長環(huán)境發(fā)生較大變化，此時(shí)是否會(huì)在體外進(jìn)行二次選擇有待探討。因此，組織來源的原代培養(yǎng)細(xì)胞用于檢測化療藥物敏感性的可行度尚待進(jìn)一步研究確定。而本實(shí)驗(yàn)嘗試對肺癌患者的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體

4、外培養(yǎng)，考慮到多數(shù)患者診斷時(shí)已處于晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，因此選擇肺癌合并胸腔積液患者，獲取胸水中的腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)及鑒定，并檢測其在體外對化療藥物的敏感性，該方法簡單、安全，且更接近標(biāo)本的生長環(huán)境，有望為下一步的個(gè)體化治療提供臨床依據(jù)。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)嘗試對肺癌患者的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，考慮到多數(shù)患者診斷時(shí)已處于晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，因此選擇肺癌合并胸腔積液患者，分離胸腔積液中的肺癌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過免疫熒光

5、和裸鼠皮下移植瘤模型的建立鑒定體外培養(yǎng)是否成功。采用MTS比色法檢測經(jīng)過鑒定的細(xì)胞系對臨床常用化療藥物的敏感性，通過與臨床資料對比，進(jìn)一步判斷其是否具有預(yù)測腫瘤藥物敏感性、指導(dǎo)臨床治療的作用。
　　方法：
　　與鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科密切配合，無菌條件下收取最終診斷為“肺癌合并胸腔積液”的患者的胸水100mL于2個(gè)50mL離心管中，30分鐘內(nèi)帶至實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)過處理后以含10%胎牛血清的DMEM/F12+GlutaMAX-

6、l(1×)培養(yǎng)基在37℃，5%CO2，5%O2三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞傳代至20代左右時(shí)，細(xì)胞具有相似的形態(tài)特征、可以穩(wěn)定的傳代。此時(shí)通過免疫熒光（Pan-CK、TTF-1、P53、Ki67）和裸鼠皮下移植瘤的方法檢測所培養(yǎng)的細(xì)胞是否確為腫瘤細(xì)胞。對經(jīng)鑒定確定為腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞增殖能力檢測。同時(shí)采用MTS比色發(fā)測定該細(xì)胞對臨床常用化療藥物順鉑、卡鉑、培美曲塞、吉西他濱、長春瑞濱、吉非替尼敏感性進(jìn)行測定，對比其與臨床實(shí)際藥物敏感

7、性是否一致。
　　結(jié)果：
　　成功分離并培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞系1個(gè)，經(jīng)免疫熒光和裸鼠皮下移植瘤的方法鑒定為腫瘤細(xì)胞?；熕幬锩舾行越Y(jié)果顯示該細(xì)胞系對培美曲塞、鉑類、吉非替尼均較敏感，對吉西他濱及長春瑞濱的敏感性則不及對照組。這與該患者的臨床治療效果基本一致。
　　結(jié)論：
　　胸水可以作為原代細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)本來源，較易分離純化。該來源的肺癌細(xì)胞體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果和臨床實(shí)際化療敏感性基本相符，有可能成為新的預(yù)測藥物敏感性