葉黃素介導(dǎo)AP-1失激活的抗人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖效應(yīng)及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：乳腺癌是危害女性健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，是城市女性最常見(jiàn)的癌癥，且發(fā)病率和死亡率逐年上升。乳腺癌是一種多因素，多基因相互作用引起的癌癥，但病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。目前乳腺癌的治療雖已逐漸從簡(jiǎn)單的手術(shù)、化療轉(zhuǎn)向手術(shù)、化療、放療以及生物靶向治療等多種手段綜合治療的方向，但仍會(huì)對(duì)患者身心造成巨大的創(chuàng)傷。因此，尋找高效、低副作用的天然化學(xué)藥物對(duì)乳腺癌的預(yù)防和治療具有重大意義。
　　葉黃素（Lutein）又稱(chēng)為植物黃體素，是一

2、種具有抗氧化作用的天然植物化合物，大量存在于花卉、蔬果等綠色植物中，尤其在萬(wàn)壽菊中含量最為豐富。人們通過(guò)膳食攝取的葉黃素可經(jīng)由血液輸送到各組織。流行病學(xué)研究顯示，葉黃素在保護(hù)視力、預(yù)防白內(nèi)障、延緩動(dòng)脈粥樣硬化和預(yù)防腫瘤等多方面具有重要作用。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)檢測(cè)葉黃素（Lutein）對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中激活蛋白1（activator protein1，AP-1）及其上下游信號(hào)通路中相關(guān)因子的影響，進(jìn)而研究葉黃素對(duì)人乳

3、腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制，為乳腺癌的化學(xué)預(yù)防及葉黃素作為低副作用的天然抗癌藥物的臨床研究提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1．MTT法檢測(cè)不同濃度葉黃素（Lutein）對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率。用不同濃度的葉黃素（0、5、10、20、40、80μg/ml）分別處理MCF-7細(xì)胞12、24、48h后，用MTT法檢測(cè)葉黃素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率。
　　2．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的葉黃素（0、5、10、

4、20、40、80μg/ml）分別處理MCF-7細(xì)胞24h后的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。
　　3．采用RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞中Nrf2、HO-1的mRNA的表達(dá)水平。
　　4．采用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞胞漿和細(xì)胞核中Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)水平。
　　5．根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析設(shè)置空白組、3-MA組、葉黃素組、3-MA+葉黃素組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)空

5、白組及各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期的變化及凋亡率。
　　6．采用RT-qPCR檢測(cè)空白組及各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中PI3K、AP-1、Cox-2和CyclinD1的mRNA表達(dá)水平。
　　7．采用Western blot檢測(cè)空白組及各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中PI3K、AP-1、Cox-2和CyclinD1的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1．MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，葉黃素能夠抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖，且抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性，即作用時(shí)間

6、越長(zhǎng)，用藥濃度越大時(shí)，對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用越強(qiáng)。
　　2．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞中ROS水平有差異，且隨著葉黃素濃度的增大，ROS水平降低更顯著。
　　3．RT-qPCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，各濃度組Nrf2、HO-1的mRNA表達(dá)水平均上調(diào)。
　　4．Western blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，HO-1的蛋白表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，細(xì)胞胞漿中Nrf2的蛋白含量基本無(wú)差異，而核Nrf2蛋

7、白的含量明顯上調(diào)。
　　5．Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，24h的3-MA組、葉黃素組（40μg/ml）和3-MA+葉黃素（40μg/ml）組的細(xì)胞凋亡率與空白組相比均有明顯差異（P＜0.05），3-MA+葉黃素（40μg/ml）組細(xì)胞凋亡率明顯大于葉黃素（40μg/ml）組和3-MA組（P＜0.05），而葉黃素（40μg/ml）組與3-MA組相比，兩組無(wú)明顯差異。
　　6．細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，與

8、空白組相比，各實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞明顯增加， S期細(xì)胞明顯減少，且3-MA+葉黃素組更顯著，表現(xiàn)為顯著地G1期阻滯（P﹤0.05）。
　　7．RT-qPCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PI3K、AP-1、Cox-2、CyclinD1的mRNA表達(dá)水平各實(shí)驗(yàn)組與空白組相比均下調(diào)；葉黃素（40μg/ml）組和3-MA組相比差異較小，3-MA+葉黃素（40μg/ml）組下調(diào)更顯著（P＜0.05）。
　　8．Western blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

9、顯示，PI3K、AP-1、Cox-2、CyclinD1的蛋白表達(dá)水平各實(shí)驗(yàn)組與空白組相比均下調(diào)；葉黃素（40μg/ml）組和3-MA組相比差異較小，3-MA+葉黃素（40μg/ml）組下調(diào)相對(duì)更顯著（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．葉黃素可明顯抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖，抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性。
　　2．葉黃素可誘導(dǎo)Nrf2的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位，促進(jìn)抗氧化酶HO-1的表達(dá)，進(jìn)而降低氧化應(yīng)激水平。