木香中抗乳腺癌MCF-7細(xì)胞活性成分作用機理的研究.pdf

1、乳腺癌嚴(yán)重威脅著女性的健康，是女性中最常見的癌癥之一，居于女性腫瘤死亡率的第2位，發(fā)病率在發(fā)展中國家呈逐年上升趨勢。前期本實驗室通過以活性為導(dǎo)向的分段篩選平臺對6味常用于治療乳腺癌的中藥（蒲公英、木香、柴胡、瓜蔞、甘草、黃藥子）進(jìn)行篩選，最終從木香中篩選出潛在的抗乳腺癌 MCF-7細(xì)胞的活性成分：木香烴內(nèi)酯（Cos）、去氫木香內(nèi)酯(Dehy)，并發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥(Cos-Dehy)抑制 MCF-7細(xì)胞增殖的效果優(yōu)于單一活性成分，表明單一活性

2、成分及聯(lián)合用藥都具有一定的臨床應(yīng)用研究價值。
　　細(xì)胞凋亡在抗癌藥物的研發(fā)中具有不可替代的作用，MCF-7細(xì)胞是雌激素受體陽性（Estrogen receptor-positive，ER+）細(xì)胞系，是ER+乳腺癌臨床前研究的經(jīng)典細(xì)胞系。目前雖然有文獻(xiàn)報道Cos具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用，但是缺乏對木香中活性成分單一用藥及聯(lián)合用藥在誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡方面的系統(tǒng)研究與對比分析。
　　代謝組學(xué)主要以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS

3、）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）等檢測靈敏度高的分析儀器作為分析手段來測定代謝小分子在內(nèi)（基因等）、外（溫度、營養(yǎng)、藥物等）刺激作用下其種類及數(shù)量變化規(guī)律的一種研究方法，因此它可以用來測定木香的活性成分作用于MCF-7細(xì)胞后所引起代謝物的變化趨勢。目前，將細(xì)胞代謝組學(xué)的方法用于考察木香中活性成分（Cos、Dehy、Cos-Dehy）對MCF-7細(xì)胞內(nèi)代謝物影響的研究仍未見報道。
　　同時，代謝組學(xué)結(jié)合傳統(tǒng)生物學(xué)方法研究Cos、

4、Dehy及Cos-Dehy誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡作用機制的報道亦較少。本課題以不同濃度Cos、Dehy及Cos-Dehy作用于MCF-7細(xì)胞，考察細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS，Ractive Oxygen Species)含量以及線粒體跨膜電位（MTP，Mitochondrial Transmembrane Potential）的變化，并結(jié)合GC-TOF/MS分析技術(shù)探究藥物作用前后細(xì)胞內(nèi)小分子代謝物的變化，對木香中活性成分及聯(lián)合用藥誘導(dǎo) MCF-

5、7細(xì)胞凋亡作用的機制進(jìn)行深入探究及對比分析，為藥物作用機制研究提供了新的分析思路。
　　本論文首先研究了不同濃度梯度(0、2、4、8μg/mL)的Cos、Dehy及Cos-Dehy干預(yù)下MCF-7細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。實驗結(jié)果表明，Cos、Dehy及Cos-Dehy都能夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，并且Cos-Dehy誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果優(yōu)于單一活性成分的作用。并進(jìn)一步對不同濃度梯度(0、2、4、8μg/mL) Cos、Dehy及Cos-De

6、hy干預(yù)作用下MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS含量及MTP的變化進(jìn)行詳細(xì)研究。發(fā)現(xiàn)，ROS含量升高、MTP降低是Cos、Dehy及Cos-Dehy誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的因素之一。
　　第二，采用基于GC-TOF/MS的細(xì)胞代謝組學(xué)研究方法探索了Cos、Dehy及Cos-Dehy作用于MCF-7細(xì)胞24 h后細(xì)胞內(nèi)代謝物的變化。本部分首先對對照組及細(xì)胞前處理方法進(jìn)行了考察，以期得到盡可能多而且準(zhǔn)確的代謝差異物。細(xì)胞加藥孵育24 h后，經(jīng)過一

7、系列的前處理步驟，樣品進(jìn)行GC-TOF/MS分析，然后采用多維統(tǒng)計中無監(jiān)督的主成分分析（PCA）及有監(jiān)督的偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）分析，最終尋找出藥物作用組與對照組之間的代謝差異物。PCA分析顯示，Cos、Dehy及Cos-Dehy與對照組都能夠呈現(xiàn)很好的分離趨勢，并且Cos-Dehy組與對照組的距離相對于Cos組與Dehy組較遠(yuǎn)，在一定程度上說明了Cos-Dehy組引起MCF-7細(xì)胞內(nèi)代謝物的紊亂程度要高于Cos組與 D

8、ehy組的作用。有監(jiān)督的OPLS-DA分析結(jié)果顯示，Cos、Dehy及 Cos-Dehy分別與對照組有15、16、16種代謝差異物，對這些代謝差異物進(jìn)行分類匯總，共得到24種代謝物，兩種活性成分與聯(lián)合用藥對細(xì)胞內(nèi)這24種代謝物的調(diào)控方向基本一致。進(jìn)一步進(jìn)行KEGG庫檢索，得出其主要與TCA循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle)、糖酵解（Glycolysis）過程、脂肪酸代謝（Fatty acid metabolism）

9、、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）相關(guān)。
　　綜合分析細(xì)胞代謝組學(xué)與凋亡的研究結(jié)果，推測 Cos、Dehy及Cos-Dehy作用于MCF-7細(xì)胞后，通過ROS含量的升高、MTP的降低破壞了線粒體結(jié)構(gòu)，線粒體在細(xì)胞中既是能量代謝中心，因此其結(jié)構(gòu)破壞后可引起各種代謝的紊亂；同時線粒體也是多種凋亡信號通路的交匯點，其結(jié)構(gòu)受到破壞以后，位于膜間隙的與凋亡相關(guān)的蛋白可能從膜間隙釋放。最終，在藥物作用下，線粒體能量代謝

10、的紊亂及凋亡相關(guān)信號的釋放誘導(dǎo)了MCF-7細(xì)胞的凋亡。
　　另外，以GC-MS為平臺，建立了游離脂肪酸靶向代謝組學(xué)的分析方法。首先對游離脂肪酸的衍生化方法進(jìn)行了探索及對比研究，最終選用在樣品中加入25μL1％五氟芐溴與25μL1%N,N-二異丙基乙胺并在30℃反應(yīng)30 min這一條件進(jìn)行衍生化，此衍生化方法方便快捷，不需要高溫加熱，對不飽和脂肪酸的分析非常有利；后通過對GC-MS分析系統(tǒng)中溫度等各項參數(shù)的優(yōu)化，實現(xiàn)了10種脂肪酸的