膽堿能抗炎通路通過調(diào)節(jié)Th細(xì)胞亞群分化抑制病毒性心肌炎的炎癥反應(yīng).pdf

1、目的：
　　病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是指由許多不同的病毒感染引起心臟炎癥和心肌損傷的疾病。大量研究表明Th細(xì)胞（help T cell，CD4+T細(xì)胞）亞群比例和分化異常與VMC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。而我們前期研究發(fā)現(xiàn)膽堿能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP）可以減少病毒性心肌炎的Th1和Th17細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。這些都啟示我們CAP很

2、有可能通過影響Th細(xì)胞分化來抑制VMC的炎癥反應(yīng)。本課題旨在研究CAP對VMC小鼠的Th細(xì)胞的影響，明確Th細(xì)胞分化對VMC小鼠生存率、炎癥因子、心肌組織損傷和炎癥浸潤的作用。
　　方法：
　　細(xì)胞實驗：30只雄性4-5周齡Balb/c小鼠（上海史萊克動物中心提供），腹腔接種100TCID50的柯薩奇病毒B3(Coxsackievirus type3 Nancy株，CVB3)稀釋液0.5ml，來制作VMC動物模型，接種的第7

3、天，從存活的小鼠中隨機(jī)選出10只小鼠安樂死，無菌取出脾臟，提取 Th細(xì)胞轉(zhuǎn)入12孔板，隨機(jī)將細(xì)胞分成3組：PBS組(PBS)，煙堿組（Nicotine）和甲基牛扁堿組(Methyllycaconitine，MLA)。煙堿組給予煙堿（100μmol/L） PBS溶液，甲基牛扁堿組給予甲基牛扁堿（100μmol/L）PBS溶液，PBS組給予等劑量的PBS。培養(yǎng)5天后使用流式細(xì)胞術(shù)分析各Th細(xì)胞亞群的比例，采用Western Blot法檢測T

4、h細(xì)胞相關(guān)炎癥因子及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。動物實驗：130只雄性4-5周齡Balb/c小鼠，根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果及小鼠死亡率情況，將小鼠隨機(jī)分成4組：對照組（Control，n=10），病毒性心肌炎（VMC， n=40），煙堿組（Nicotine，n=40），甲基牛扁堿組（Methyllycaconitine，MLA， n=40）。其中煙堿組，VMC組和甲基牛扁堿組小鼠使用同種方式接種100TCID50的CVB3病毒稀釋液0.5ml來制作VMC

5、模型，對照組小鼠注射同等劑量的DMEM液,將病毒感染的第一天作為第0天。從第1天開始，煙堿組小鼠每天腹腔注射煙堿（0.4mg/kg，一天三次）生理鹽水溶液，MLA組小鼠每天腹腔注射甲基牛扁堿（2.4mg/kg，每天一次）生理鹽水溶液，對照組和VMC組小鼠每天腹腔注射等量的生理鹽水，連續(xù)給藥14天，觀察各組的一般生長情況和死亡情況。于第7天和14天時在各組小鼠分別取出5只處死，制作病理切片，HE染色觀察小鼠心肌損失和炎癥浸潤，q-PCR檢

6、測各組小鼠心肌中 CVB3病毒 RNA的豐度，Western Blot檢測各組小鼠心肌組織促炎因子、Th細(xì)胞相關(guān)炎癥因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測7天時小鼠脾臟Th細(xì)胞亞群比例。
　　結(jié)果：
　　①細(xì)胞實驗結(jié)果：Th細(xì)胞亞群相關(guān)特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化：與PBS組和甲基牛扁組相比，煙堿治療降低了Th1和Th17細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(T-bet、Ror-γ)，增加了Th2和Treg細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Gata3、Foxp3）（

7、P＜0.05）；Th細(xì)胞亞群變化：煙堿組的Th1和Th17細(xì)胞比例升高，Th2和Treg細(xì)胞比例下降（P＜0.05）。②動物實驗結(jié)果：小鼠生存率變化：對照組生存率為100％，煙堿組的生存率為60%（死亡16只），顯著高于VMC組小鼠的生存率45%（死亡22只）和MLA組小鼠的生存率30%（死亡28只）(P＜0.05)；HE染色：7天和14天時，對照組小鼠心肌未發(fā)現(xiàn)心肌損傷和炎癥浸潤。與VMC組和MLA組相比，煙堿組小鼠的心肌損害和炎癥浸

8、潤顯著下降了(P＜0.05)；各組小鼠心肌中CVB3病毒 RNA豐度：第7天和14天時，在各實驗組之間，心肌中CVB3病毒RNA沒有明顯差異；各組小鼠心肌中促炎因子的表達(dá)變化：在7天時，與VMC組和MLA組相比，煙堿治療可以降低心肌中的TNF-α、IL-1β及IL-6表達(dá)（P＜0.05），然而在第14天時，各組之間的炎癥因子表達(dá)量卻沒有差異；心肌中Th細(xì)胞各亞群相關(guān)的特異性炎癥因子和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)變化：與病毒性心肌炎組和甲基牛扁堿組相比，

9、煙堿治療后，7天時小鼠心肌中T-bet、IFN-γ、ROR-γ和IL-17表達(dá)下調(diào)，但Gata3、IL-4和Foxp3表達(dá)量卻上升了（P＜0.05）。14天時，T-bet、IFN-γ、ROR-γ、IL-17、Gata3、IL-4和Foxp3在煙堿組、VMC組和MLA組之間沒有明顯差異；脾臟中Th細(xì)胞亞群比例變化：7天時，與VMC組和MLA組相比，煙堿組的Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例明顯降低，然而Th2細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例卻明顯上升（均

10、P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　驗證了激活CAP對VMC鼠脾臟中Th細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用。煙堿均能激活在體和離體脾臟 Th表面的α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7-nAChR），增加脾臟Th2和Treg細(xì)胞的比例，減少脾臟Th1和Th17細(xì)胞的比例，同時降低病毒感染后心肌間質(zhì)浸潤的淋巴細(xì)胞中Th1和Th17細(xì)胞的比例，升高Th2和Treg細(xì)胞的比例，進(jìn)而下調(diào)心