MicroRNA145-Adducin3通路及GBP-1在膽道閉鎖發(fā)病中增殖紊亂的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　通過對MicroRNA145、Adducin3及GBP-1在膽道閉鎖(biliary atresia，BA)患兒肝臟組織中的表達(dá)水平變化，探討MicroRNA145-Adducin3通路及GBP-1在膽道閉鎖發(fā)病中增殖紊亂的作用及其作用機(jī)制。
　　方法:
　　選取深圳市兒童醫(yī)院2013年1月至2016年1月收治的臨床及病理診斷為膽道閉鎖的患兒60例（研究組），對照組選取同期年齡在6個月之內(nèi)的非膽汁淤積性肝病

2、且肝功能正常的患兒54例。第一部分:通過裂解研究組及對照組的肝組織并提取其總RNA后，分別用mRNA RT-PCR及MicroRNA RT-PCR法反轉(zhuǎn)錄、qPCR熒光定量分析法，檢測BA肝組織中的ADD3 mRNA及MicroRNA-145的表達(dá)水平。第二部分:構(gòu)建高表達(dá)MicroRNA-145、低表達(dá)Microrna-145慢病毒，并分別轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞內(nèi)，用RT-PCR反轉(zhuǎn)錄及qPCR熒光定量、western blot方法分別

3、檢測不同MicroRNA-145表達(dá)量的細(xì)胞內(nèi)ADD3mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平。第三部分:檢測GBP-1在不同程度肝臟纖維化肝臟組織中的表達(dá)，并利用自動醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)對其進(jìn)行定量。第四部分:擬構(gòu)建GBP1基因慢病毒載體，轉(zhuǎn)染肝臟細(xì)胞從而上調(diào)其在肝臟細(xì)胞中的表達(dá)，探討該基因高表達(dá)后對其下游因子尤其是MMPs表達(dá)的影響及對肝臟細(xì)胞的影響。
　　結(jié)果:
　　第一部分: ADD3 mRNA在BA組肝組織中表達(dá)量為4.63

4、8±0.3327，在對照組中表達(dá)為1.167±0.1053;MicroRNA-145在BA組肝組織中表達(dá)為0.1578±0.03217，在對照組中表達(dá)為0.4557±0.1244。BA組肝組織中ADD3較對照組的明顯升高(p＜0.05)，MicroRNA-145較對照組的明顯降低(p＜0.05)。第二部分:空白對照組的HepG2細(xì)胞內(nèi)存在ADD3 mRNA及蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)表達(dá)量，轉(zhuǎn)染高表達(dá)MicroRNA-145后的HepG2細(xì)胞，其AD

5、D3mRNA水平及蛋白質(zhì)水平均較對照組細(xì)胞的低，而轉(zhuǎn)染低表達(dá)MicroRNA-145后的細(xì)胞，其ADD3mRNA水平及蛋白質(zhì)水平均明顯低于對照組細(xì)胞。第三部分:GBP1在對照組肝臟組織中呈陰性表達(dá);在BA肝臟組織中呈現(xiàn)不同程度表達(dá)，隨著肝臟纖維化程度的加重，GBP-1表達(dá)水平增高。第四部分:TUNEL法檢測HepG2凋亡情況發(fā)現(xiàn)，空載體質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染對照HepG2細(xì)胞未檢測到凋亡，而轉(zhuǎn)染Pcmv6-gbp1的HepG2細(xì)胞出現(xiàn)較多凋亡細(xì)胞

6、。ELISA定量檢測發(fā)現(xiàn)，MMP-1和MMP-2在pCMV6-gbp1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞上清中表達(dá)降低，與對照組和空載體質(zhì)粒組統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、ADD3的過度表達(dá)可能與BA的發(fā)病相關(guān)。2、MicroRNA-145可能通過靶向作用于ADD33'UTR序列來改變ADD3的表達(dá)，而誘發(fā)了BA的發(fā)生。3、GBP1可能與BA肝臟組織肝纖維化密切相關(guān)。4、GBP1可能通過促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡和抑制MMP-1和M