MCL1、AF1q和microRNA在白血病中的作用及其機制研究.pdf

1、本文對MCL1、AF1q和microRNA在白血病中的作用及其機制進行了研究。本研究分為兩個部分：
　　 第一部分：MCL1基因在白血病多藥耐藥機制中的作用研究。
　　 背景：白血病(leukemia)是一類以惡性克隆性白血病細(xì)胞增殖異常、分化障礙、凋亡受阻和正常造血受抑制為特點，嚴(yán)重威脅人類健康的造血系統(tǒng)惡性疾患。隨著近年來各種治療方法的發(fā)展，白血病化療的完全緩解率(complete remission，CR)有所提高

2、，但仍有60～70％的患者治療失敗或復(fù)發(fā)，其治療失敗和復(fù)發(fā)的重要原因是多藥耐藥(multi-drug resistance，MDR)的產(chǎn)生。白血病耐藥機制非常復(fù)雜，其中抗凋亡蛋白異常高表達是導(dǎo)致MDR的重要原因之一。髓細(xì)胞白血病1基因(myeloid cell leukemia sequence1(BCL2-related)，MCL1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種抗凋亡基因，屬BCL2家族成員。MCL1與BCL2和BCL2L1作用類似，能與BAX

3、、BAK1相互作用，從而抑制線粒體途徑的凋亡。研究顯示，MCL1基因在多種血液系統(tǒng)腫瘤(如慢性淋巴細(xì)胞白血病)和實體腫瘤(如肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌)中表達異常增加，且MCL1基因的表達水平與腫瘤的分級、預(yù)后密切相關(guān)。此外，有研究報道，在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中，MCL1的表達與患者對強的松的敏感性顯著相關(guān)。提示MCL1基因可能在白血病耐藥中發(fā)揮重要作用。
　　 目的：研究MCL1基因在急性白血病患者中的表達水平；探討MC

4、L1異常表達對白血病細(xì)胞藥物敏感性及藥物誘導(dǎo)凋亡的影響；闡明MCL1基因在白血病多藥耐藥機制中的作用，為逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥提供新的靶點。
　　 方法：⑴標(biāo)本采集：收集47例急性髓系白血病(AML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者的骨髓標(biāo)本，分為初診/難治/復(fù)發(fā)組(27例)和完全緩解組(20例)。應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離標(biāo)本中的單個核細(xì)胞，Real time RT-PCR檢測骨髓中MCL1的表達。⑵MCL1真核表達載體的構(gòu)建：應(yīng)用

5、RT-PCR技術(shù)從白血病多藥耐藥細(xì)胞系K562/A02中擴增MCL1基因的編碼序列，將其插入到pLXSN載體中，構(gòu)建成MCL1真核表達載體pLXSN-MCL1。⑶細(xì)胞轉(zhuǎn)染：應(yīng)用LipofectamineTM2000將MCL1表達載體轉(zhuǎn)染AML細(xì)胞系K562、HL60和ALL細(xì)胞系Jurkat。應(yīng)用G418篩選至少2周獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。應(yīng)用Real time RT-PCR和Western blot分析轉(zhuǎn)染前、后MCL1 mRNA和蛋白的

6、表達變化。⑷Real time RT-PCR檢測MCL1 mRNA表達：應(yīng)用TRIzol方法提取細(xì)胞總RNA，使用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用Real time PCR檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染前、后MCL1基因mRNA水平的表達。⑸Western blot檢測MCL1蛋白表達：應(yīng)用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，12％SDS-PAGE膠進行凝膠電泳，Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染前、后細(xì)胞MCL1蛋白水平的表達。⑹MT

7、T方法檢測細(xì)胞對化療藥物敏感性：將轉(zhuǎn)染前、后的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入不同濃度的化療藥物阿霉素孵育72小時，MTT方法檢測細(xì)胞對化療藥物的敏感性，計算阿霉素的半數(shù)抑制濃度(IC50值)。⑺流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：將轉(zhuǎn)染前、后的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入化療藥物阿霉素孵育72小時，收集細(xì)胞，AnnexinV/PI雙染后利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率的變化。
　　 結(jié)果：①急性白血病患者MCL1表達情況：在初診/難治/復(fù)發(fā)組27

8、例患者中，13例(48％)患者高表達MCL1，而在完全緩解組20例患者中，僅4例(20％)患者高表達MCL1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。②MCL1真核表達載體能有效上調(diào)細(xì)胞中MCL1的表達：將pLXSN-MCL1表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K562、HL60、Jurkat細(xì)胞后，Real time RT-PCR顯示MCL1mRNA的表達水平較對照組分別增高3.3、6.3、9.6倍；Western blot顯示MCL1蛋白的表達水平較對照組亦顯著增高。③MC

9、L1表達上調(diào)后細(xì)胞對藥物敏感性的變化：MTT檢測發(fā)現(xiàn)，K562、HL60、Jurkat轉(zhuǎn)染pLXSN-MCL1表達載體后，阿霉素IC50值分別為103.05±5.79，58.11±0.92，53.12±0.64μg/L，而對照組阿霉素IC50值分別為40.60±2.90，18.14±1.07，23.27±0.75μg/L，表明高表達MCL1使細(xì)胞對阿霉素的藥物敏感性降低。④MCL1表達上調(diào)后藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡變化：K562、HL60、J

10、urkat細(xì)胞轉(zhuǎn)染pLXSN-MCL1表達載體后，阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率分別為44.18±4.54％、20.81±6.17％、29.56±2.82％，而對照組的細(xì)胞凋亡率分別為87.69±5.77％、45.46±2.56％、70.91±9.30％，表明轉(zhuǎn)染后藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減低。
　　 結(jié)論：⑴初診、難治和復(fù)發(fā)的急性白血病患者MCL1表達水平較完全緩解的患者明顯增高，提示MCL1可能在急性白血病的發(fā)生、發(fā)展中起作用。⑵MCL1

11、異常高表達可降低白血病細(xì)胞對化療藥物的敏感性。⑶MCL1異常高表達可導(dǎo)致化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率降低。⑷MCL1在白血病耐藥中發(fā)揮重要作用，有望成為白血病治療的新靶點。
　　 第二部分：MicroRNA-29b調(diào)控白血病細(xì)胞中AF1q基因的表達。
　　 背景：白血病是一類嚴(yán)重影響人類健康的血液系統(tǒng)惡性疾患，其發(fā)病機制多種多樣，部分白血病患者伴有染色體核型異常，是導(dǎo)致其發(fā)病的重要原因。AF1q基因(又名MLLT11)最初是

12、在2名伴有t(1；11)(q21；q23)的急性髓系白血病患者中發(fā)現(xiàn)的，該染色體易位形成了MLL/AF1q融合基因，從而促進白血病的發(fā)生。研究顯示，AF1q基因的表達水平在AML和ALL患者中普遍升高，且AF1q高表達在兒童AML、成人正常核型AML及骨髓增生異常綜合癥(MDS)中是一個預(yù)后不良指標(biāo)。然而，AF1q基因表達的調(diào)控機制目前并不清楚。MicroRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度為19～25nt，序列高度保守的內(nèi)源性非

13、編碼小RNA分子。成熟miRNA能與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合，引起靶基因mRNA的降解或翻譯抑制，從而下調(diào)靶基因蛋白的表達。目前在人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)700多種miRNA分子，平均每個miRNA能調(diào)節(jié)200種基因的表達，對至少1/3的人類基因起重要的調(diào)節(jié)作用。研究顯示，miRNA在白血病中存在異常表達，且與白血病細(xì)胞的生長、增殖、凋亡密切相關(guān)，可作為臨床分型、分期的標(biāo)準(zhǔn)，能提示患者的預(yù)后情況。因此，我們推斷AF1q基因的表達

14、很可能受某種miRNA調(diào)控。
　　 目的：研究在白血病中可能調(diào)控AF1q基因表達的miRNA分子；探討miR-29b在白血病細(xì)胞AF1q表達調(diào)控中的作用，闡明其作用機制，為白血病提供新的預(yù)后指標(biāo)。
　　 方法：①計算機預(yù)測miRNA：應(yīng)用TargetScanHuman和miRGen軟件預(yù)測可能調(diào)控AF1q基因表達的miRNA。②標(biāo)本采集：收集56例AML患者的骨髓標(biāo)本，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞，應(yīng)用生物芯

15、片技術(shù)(Micoarray)和Real time PCR檢測患者miR-29b、AF1q的表達情況，分析miR-29b表達水平與AML患者預(yù)后的關(guān)系。③載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染：從細(xì)胞mRNA中擴增出AF1q基因3'UTR片段及3'UTRmiR-29b結(jié)合位點突變片段，將其插入載體pEGFP-C1中，構(gòu)建成GFP報告質(zhì)粒pGFP-A3U及pGFP-A3U-M。應(yīng)用LipofectamineTM2000將GFP報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H157細(xì)胞，G418篩選

16、新霉素抗性細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分選GFP陽性細(xì)胞。④Mimic細(xì)胞轉(zhuǎn)染：應(yīng)用LipofectamineTM2000將miR-29b mimic及陰性對照mimic轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞系REH和兩種肺癌細(xì)胞系H157、SKMES1，72小時后收集細(xì)胞，應(yīng)用Real time RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后AF1q基因mRNA表達，Western blot檢測AF1q蛋白表達。⑤Real time RT-PCR：應(yīng)用TRIzol方法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試

17、劑盒獲得cDNA，Real time PCR檢測AF1q、GFP、β2M基因mRNA水平的表達。⑥Western blot：GLB細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞總蛋白，4-12％NuPAGE膠進行凝膠電泳，Western blot方法檢測AF1q蛋白水平的表達。
　　 結(jié)果：⑴計算機預(yù)測顯示miR-29a/b/c與AF1q基因3’UTR完全匹配，可能是調(diào)控AF1q基因表達的miRNA。⑵Microarray顯示：56例AML患者中miR-2

18、9b的表達水平與AF1q基因表達水平呈負(fù)相關(guān)，即低表達miR-29b的患者存在AF1q高表達，且低表達miR-29b的AML患者總生存率較miR-29b高表達的患者差。⑶將miR-29b轉(zhuǎn)染REH、H157和SKMES1細(xì)胞后，Real time RT-PCR顯示AF1qmRNA的表達水平較陰性對照組降低，Western blot顯示AF1q蛋白表達水平較陰性對照組下調(diào)。⑷將GFP報告載體pGFP-A3U及pGFP-A3U-M轉(zhuǎn)染H15