+RNA病毒入侵與復(fù)制關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、EV71（enterovirus71）是引起重癥手足口病的首要病原體，它屬于微小核糖核酸病毒科(picornaviridae)腸道病毒屬(Eentervirus genus)。EV71可以引起嚴(yán)重的中樞系統(tǒng)感染，并有較高的死亡率，其感染癥狀包括:腦膜炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹和急性神經(jīng)性肺水腫等。2007年EV71在山東臨沂爆發(fā)，緊接著于2008年在安徽阜陽爆發(fā)，這兩次爆發(fā)直接拉開了EV71在中國內(nèi)地持續(xù)流行的序幕。根據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心公

2、開的數(shù)據(jù)，中國自2008年以來每年新發(fā)手足口病例超過百萬，位居丙類傳染病之首。因此，EV71引起的公共衛(wèi)生威脅不容忽視。
　　EV71具有一個約7400個核糖核苷酸組成的單股正鏈RNA基因組，它編碼了一個約250kDa的前體蛋白(Polyprotein)。病毒前體蛋白需要進(jìn)行成熟化切割才能形成具有功能的蛋白，這一酶切過程由病毒蛋白酶2A和3C完成，并最終產(chǎn)生10個成熟蛋白，包括3種結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白）:VP0，VP1和VP3，以及

3、7種非結(jié)構(gòu)蛋白:2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D。結(jié)構(gòu)蛋白組裝成正二十面體的病毒衣殼，保護(hù)病毒的基因組、復(fù)制酶并介導(dǎo)病毒入侵;非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒成熟，復(fù)制和天然免疫逃逸等病毒生命周期中的關(guān)鍵步驟。
　　2C蛋白是微小核糖核酸病毒中最保守的蛋白之一，根據(jù)氨基酸序列分析，它屬于AAA+ATPase家族的SF3Helicase超家族。研究人員發(fā)現(xiàn)，與其它正鏈RNA病毒相同，EV71基因組復(fù)制過程發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中特征性的膜結(jié)構(gòu)中。非

4、結(jié)構(gòu)蛋白2C及其前體蛋白2BC介導(dǎo)了病毒感染的細(xì)胞中膜組分的變構(gòu)及基于膜結(jié)構(gòu)的病毒復(fù)制復(fù)合物的組裝。此外2C蛋白還參與了病毒生命周期中的其他重要過程，包括病毒脫殼，天然免疫逃逸和病毒衣殼的形成等。由于2C蛋白含有膜結(jié)合區(qū)，高度不穩(wěn)定，難以結(jié)晶，其高分辨率晶體結(jié)構(gòu)一直未知，并阻礙了人們對2C功能的深入理解和抑制劑的設(shè)計。
　　成功解析了EV71-2C蛋白116-329段2.5(A)的晶體結(jié)構(gòu)，以及EV71-2C蛋白116-329段與

5、ATP-γ-S2.5(A)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，這是首次獲得微小核糖核酸病毒2C蛋白的結(jié)構(gòu)。2C蛋白的結(jié)構(gòu)包括三部分:一個傳統(tǒng)的ATPase結(jié)構(gòu)域，一個比較少見的由三個半胱氨酸(C270，C281，C286)構(gòu)成的鋅指結(jié)構(gòu)和一個C末端兩親性α螺旋（也稱為pocket binding domain，PBD）。其中ATPase結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域共同構(gòu)成一個疏水性“口袋”。不同于其它AAA+ATPases，EV71-2C蛋白的C末端兩親性α螺旋通

6、過疏水相互作用與另外一個2C蛋白的疏水性“口袋”相互結(jié)合，從而介導(dǎo)了2C蛋白自身的寡聚化。分子篩柱層析和X射線小角散射實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明2C蛋白的寡聚化在溶液中是穩(wěn)定存在的，排除了這種寡聚化是由晶體堆積造成的可能性。繼而將參與2C-2C結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行點(diǎn)突變研究，突變體的ATPase酶活實(shí)驗(yàn)和重組病毒包裝實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這種寡聚化是2C發(fā)揮ATPase活性和EV71病毒復(fù)制所必須的。AAA+ATPase家族的蛋白通常會形成環(huán)狀六聚體結(jié)構(gòu)，以人