Dynamitin調(diào)控雄性果蠅生殖和幼蟲發(fā)育的機制研究.pdf

1、Dynamitin(Dmn)又名DCTN2-p50，該基因編碼動力蛋白激活蛋白(dynactin)的核心亞基Dmn，Dmn是dynactin復合體聚合以及連接Arp1纖維和側(cè)臂的關鍵因子，同時也是dynactin復合體與動力蛋白(dynein)和微管(tubulin)蛋白相連接的重要結(jié)構(gòu)。細胞中許多運動事件都是通過dynein-dynactin復合體來進行調(diào)節(jié)的。
　　研究組已有研究結(jié)果顯示:一種內(nèi)共生菌Wolbachia感染，導

2、致果蠅產(chǎn)生細胞質(zhì)不親和(CI)表型，即感染W(wǎng)olbachia的雄性果蠅與未感染或者感染不同品系Wolbachia的雌性果蠅進行交配時，后代胚胎成活率顯著降低或沒有后代存活。為了深入探究果蠅感染W(wǎng)olbachia引起CI的分子機理，研究組通過microarry技術檢測了未感染和感染W(wǎng)olbachia的三齡幼蟲精巢中基因表達情況，共鑒定到296種差異表達的基因（差異倍數(shù)均在1.5倍以上），其中167個基因表達量上調(diào)，129個基因表達量下調(diào)。

3、研究組還通過比較蛋白組學，研究了與感染和未感染W(wǎng)olbachia的1日齡雄性交配2h后雌性受精囊和納精囊中的差異表達蛋白，鑒定到了83個差異表達的蛋白。在microarry和蛋白組學檢測中，Dmn表達量在Wolbachia感染后均呈下調(diào)趨勢，暗示其可能在雄性果蠅的生殖過程中起重要作用，因此選用RNAi干擾品系，用UAS/Gal4系統(tǒng)驅(qū)動Dmn在果蠅中特異性敲降，以研究Dmn在雄性果蠅繁殖過程中的作用及與CI的關系。
　　首先通過熒

4、光定量RT-PCR(qRT-PCR)的方法，驗證了Wolbachia感染對果蠅精巢中Dmn表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，wMel Wolbachia感染確實引起果蠅精巢內(nèi)Dmn表達量極顯著下調(diào)(P＜0.01)。然后，通過用UAS/Gal4系統(tǒng)，選用nosGal4驅(qū)動Dmn在果蠅性腺中敲降，探究Dmn在雄性果蠅繁殖過程中的作用。選取了兩個Dmn的干擾品系（干擾序列有差異）:Dmn-hp-1和Dmn-hp-2，與nosGal4/TM6B處女蠅交配，

5、得到Dmn在精巢中敲降的雄蠅nosGal4/Dmn-hp-1和nosGal4/Dmn-hp-2。再用Dmn在精巢中敲降的雄蠅與野生處女蠅交配后，統(tǒng)計胚胎的孵化率，結(jié)果顯示，胚胎孵化率分別為28.97±4.14％和42.34±4.40％，均極顯著低于對照組的90.64±3.32％，產(chǎn)生了類似Wolbachia感染引起CI的表型。這一結(jié)果說明，Wolbachia感染引起果蠅精巢內(nèi)Dmn表達量極顯著下調(diào)，可能是Wolbachia感染引起CI的

6、原因之一。為進一步研究Dmn在Wolbachia感染的果蠅精巢內(nèi)表達量下調(diào)是否與CI相關，在Wolbachia感染的果蠅精巢內(nèi)過量表達Dmn，看其是否能挽救雄果蠅的育性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Wolbachia感染的果蠅精巢內(nèi)過量表Dmn后，確實能夠挽救雄果蠅的育性，其子代胚胎孵化率恢復至77.84％，表明Wolbachia感染引起果蠅精巢內(nèi)Dmn表達量下調(diào)，確實是引起CI的原因。
　　為了研究Dmn影響雄性果蠅育性的機制，采用免疫組化和透

7、射電鏡技術對Dmn敲降精巢中精子發(fā)生過程進行分析（后續(xù)研究都用的是Dmn-hp-1品系）。DAPI染色顯示，與對照組相比，Dmn敲降精巢前端比較膨大，精巢基部精子束較少，且精子核濃縮程度低，在精子束周圍，還散布一些處于獨木舟階段的精細胞。在精巢末端，對照組分布有核高度濃縮成針形的精子，而在Dmn敲降組精子核還沒有高度濃縮就從包囊中脫離出來。在最后的儲精囊中，對照組充滿成熟的精子，而Dmn敲降組中精子較少，大約為對照組的40％，這表明Dm

8、n在精巢中敲降破壞了精子發(fā)生過程，降低了精子的產(chǎn)生量，可能因而降低了雄性果蠅的育性。
　　正常條件下，在果蠅精子發(fā)生的第二次成熟分裂末期，線粒體聚集、融合，將發(fā)育為線粒體衍生物，進而發(fā)育為副核(nebenkern)。透射電鏡結(jié)果顯示:在第二次成熟分裂末期，對照組精細胞中有許多線粒體聚集在一起，其中部分線粒體已開始融合，而Dmn敲降組精細胞中線粒體較少，且沒有聚集。之后，在精母細胞經(jīng)過2次成熟分裂形成64個圓形精細胞的包囊中，對照組

9、精細胞排列整齊有序，每一個精細胞有一個大的線粒體衍生物靠近一個軸絲，而在Dmn敲降組精細胞的包囊中，精細胞排列較為混亂，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)精細胞膜融合的現(xiàn)象，在一個細胞膜內(nèi)有多個軸絲——線粒體對，也觀察到有多個線粒體衍生物伴隨一個軸絲的現(xiàn)象。在精子伸長階段，在對照組包囊橫切面上可以觀察到，每一個精子都包含一個副核伴隨一個軸絲，排列方向一致，而在Dmn敲降組中，精子排列無序，有時可以觀察到，兩對軸絲——線粒體通過兩個連在一起的小的線粒體衍生物連在一

10、起，部分副核沒有高度濃縮。在精子個體化階段，Dmn敲降組精細胞的包囊膜迅速內(nèi)陷，包囊中部分精子發(fā)生退化，這可能是未成熟精子過早從包囊中釋放且精子數(shù)量少的原因。
　　抗體染色顯示，Dmn在雄性生殖干細胞中沒有表達。當生殖干細胞開始分化，經(jīng)過四輪同步分裂形成16個精原細胞組成包囊時，Dmn開始表達。在對照組精母細胞分裂的前中期，在星狀體微管和紡錘體的兩極Dmn信號較強，在著絲粒處也有Dmn的表達，在這個過程中，dynein幾乎與Dmn

11、共定位。而在Dmn敲降組精母細胞分裂的前中期，Dmn的信號強度顯著低于對照組(P＜0.05)。隨著精子的成熟，Dmn和dynein的信號逐漸減弱，最后消失，說明它們可能與多余的細胞質(zhì)一起被排出精子之外。Dmn敲降也導致精細胞中dynein和tubulin表達下降，這也可能是精子不能正常形成的原因。
　　精子發(fā)生的最后步驟就是個體化過程和成熟精子的卷曲。個體化過程通過形成個體化復合體(individualization comple

12、x，IC)來完成。IC由64個環(huán)繞針狀精核的肌動蛋白(F-actin)椎體組成。在個體化過程中，IC從精子頭部沿著軸絲向精子尾部運動，去除多余的細胞質(zhì)和細胞器，每個精子之間形成新的細胞膜，完成精子個體化過程，形成獨立的有活力的成熟精子。在Dmn敲降精巢中，精子束結(jié)構(gòu)分散，且大部分精子束沒有形成完整有序的個體化復合體，在精巢中有散亂的F-actin分布。另外，與對照組相比，在Dmn敲降精巢中，個體化復合體沿著精子束移動的速度較慢，精子仍處

13、于個體化的初期狀態(tài)，仍有部分精子束沒有個體化復合體形成。這一結(jié)果表明，Dmn可調(diào)控F-actin的聚集以及IC的形成，因而影響精子個體化過程。
　　由于Dmn敲降產(chǎn)生的部分表型與Lis-1、Spag4、Yuri、Ddlc1、DCTN1-p150和ATPsys-b等基因突變引起的表型相似，又通過qRT-PCR的方法檢測Dmn敲降對這些基因表達的影響，結(jié)果顯示，Dmn在果蠅精巢中敲降也引起這些基因在精巢中的表達顯著下調(diào)。為了研究這些基

14、因是否與Dmn相互作用，選擇了Ddlc1（編碼果蠅的Dynein輕鏈）進行進一步探索。將Ddlc1在Dmn敲降的果蠅精巢中過量表達，檢測其是否能挽救由于Dmn敲降引起雄性果蠅育性下降的表型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ddlc1在Dmn敲降的果蠅精巢中過量表達的確能夠挽救由于Dmn敲降引起雄性果蠅育性缺陷，子代胚胎孵化率恢復至89.95±2.73％。因此，Dmn基因的確與這些精子發(fā)生相關基因之間存在相互作用關系，共同調(diào)控果蠅的精子發(fā)生過程。
　　還

15、選用actGal4驅(qū)動Dmn在果蠅全身廣泛敲降，來探究Dmn在果蠅發(fā)育過程中作用。結(jié)果顯示，Dmn在果蠅全身廣泛敲降后，導致敲果蠅只能發(fā)育至幼蟲階段，不能化蛹，并最終在幼蟲期死亡。根據(jù)相關文獻報道，影響果蠅幼蟲發(fā)育的信號通路主要是保幼激素信號通路和蛻皮激素信號通路。在本研究中，對幼蟲的蛻皮情況進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Dmn全身廣泛敲降的幼蟲蛻皮情況與對照組差異不顯著，因此，推測，Dmn敲降后可能影響了保幼激素信號通路。因此，檢測了與保幼激素

16、相關的基因JhI-26、Met和Kr-h1在Dmn全身廣泛敲降的幼蟲中的表達量。結(jié)果顯示，3個基因的表達量均發(fā)生顯著上調(diào)。因此，推斷，Dmn對幼蟲生長的影響是通過調(diào)控與保幼激素相關的基因JhI-26、Met和Kr-h1上調(diào)表達來誘導保幼激素過度表達，使幼蟲不能化蛹。
　　綜上所述，Dmn不僅在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，而且在調(diào)控幼蟲的生長發(fā)育過程中也有重要的功能。本研究還發(fā)現(xiàn)，Wolbachia感染引起果蠅精巢中Dmn表達