血小板來(lái)源微泡中miRNA-223參與小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景：
　　微泡主要存在于血小板中，內(nèi)部含有多種microRNAs、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)，參與細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。大量研究表明，在動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的患者的血液中，微泡的含量明顯增多。MicroRNAs是目前廣泛研究的基因表達(dá)調(diào)控因子，其結(jié)構(gòu)為長(zhǎng)約22～25核苷酸的單鏈RNA分子。近年來(lái)，miRNAs在心血管系統(tǒng)中的重要調(diào)控作用不斷得以闡明，取得了令人矚目的研究成果。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，血小板在被激活以后，其分泌的微泡中

2、多種miRNAs的含量發(fā)生改變，且可以被內(nèi)皮細(xì)胞吸收，從而影響其增殖、遷移、凋亡、分泌。在這當(dāng)中，miRNA-223的含量改變最為顯著。隨著研究的進(jìn)展，miRNA-223在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中發(fā)揮的作用越來(lái)越受到重視，作用機(jī)制也越來(lái)越明確，有可能成為診斷和治療動(dòng)脈粥樣硬化的新型生物靶點(diǎn)。
　　二、研究目的：
　　1、以C57BL/6純系A(chǔ)poE基因敲除小鼠為基本研究對(duì)象，建立適當(dāng)?shù)膭?dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒⑦M(jìn)行分組，為探索PMP中miRN

3、A-223在動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮損傷修復(fù)機(jī)制提供可靠有力的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　2、檢測(cè)對(duì)比各組小鼠之間血脂水平以及血小板來(lái)源的微泡中miRNA-223含量的差異。
　　3、分析各組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變程度，初步探索動(dòng)脈粥樣硬化病變程度與血小板來(lái)源微泡中miRNA-223含量之間的關(guān)系。
　　三、研究方法：
　　1、以6周齡左右的C57BL/6純系背景的載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)雄性小鼠12只以及同周齡的C5

4、7BL/6普通雄性小鼠6只為研究對(duì)象，在相同的飼養(yǎng)條件下分成三組，即給予高脂飲食，尾靜脈注射miRNA-223 antagomir抑制miRNA-223轉(zhuǎn)錄表達(dá)的ApoE-/-小鼠組（AG組）;給予高脂飲食，經(jīng)尾靜脈注入同劑量生理鹽水的ApoE-/-小鼠組（AE組）;給予SPF全價(jià)營(yíng)養(yǎng)鼠料飼養(yǎng)，經(jīng)尾靜脈注入同劑量生理鹽水的普通小鼠組（對(duì)照組）。
　　2、飼養(yǎng)至12周后對(duì)三組小鼠進(jìn)行稱重，處死，取血，離心取上清液，使用全自動(dòng)生化分析

5、儀檢測(cè)各組小鼠體內(nèi)血脂水平;提取小鼠血液中的血小板微泡，實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定PMP中miRNA-223的含量。
　　3、對(duì)各組小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化情況進(jìn)行標(biāo)本大體觀察，HE染色后光學(xué)顯微鏡下病理觀察以及使用醫(yī)學(xué)數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)生斑塊的厚度、面積進(jìn)行定量分析。
　　四、研究結(jié)果
　　1、小鼠自購(gòu)入經(jīng)喂養(yǎng)、處置至處死前，18只實(shí)驗(yàn)小鼠均成功存活，生命跡象良好，無(wú)死亡、疾病、厭食等不良狀況。對(duì)三組小鼠分別進(jìn)行稱重，AG組為（

6、27.21±2.05）g，AE組為（27.72±2.59）g，對(duì)照組為(23.51±1.55)g。稱重結(jié)果顯示:AG組與AE組小鼠體重?zé)o明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，AG組與對(duì)照組、AE組與對(duì)照組體重有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05，P＜0.05)，AG、AE兩組小鼠體重水平均高于對(duì)照組小鼠。
　　2、通過(guò)梯度離心、超速離心、逆轉(zhuǎn)錄以及定量PCR等方法對(duì)三組小鼠體內(nèi)PMP中miRNA-223相對(duì)水平進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比，結(jié)果顯示:AG組小鼠體

7、內(nèi)PMP中miRNA-223的含量較其它兩組明顯下降，而AE組含量較對(duì)照組升高。折換成倍數(shù)顯示:AG組與對(duì)照組為（0.14±0.06vs1.02±0.09，P＜0.05）;AG與AE組為(0.14±0.06vs2.71±0.44，P＜0.05)，AE組與對(duì)照組為（2.71±0.44vs1.02±0.09，P＜0.05）。對(duì)各組小鼠體內(nèi)的血脂水平檢測(cè)結(jié)果顯示，三組小鼠的TG、TC、LDL-C、HDL-C水平分別為AG組(0.60±0.08

8、mmol/L,11.03±1.29 mmol/L,5.06±0.86 mmol/L,0.75±0.99 mmol/L),AE組（0.61±0.10 mmol/L,11.07±1.53 mmol/L,5.13±1.13 mmol/L,0.70±0.99 mmol/L），對(duì)照組（0.34±0.70 mmol/L，3.18±0.54 mmol/L，1.59±0.36 mmol/L，2.28±0.37 mmol/L）。AG組與AE組小鼠TG、T

9、C以及LDL-C和HDL-C水平均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，與對(duì)照組相比AG組與AE組的TG、TC以及LDL-C水平均明顯升高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05，P＜0.05)，HDL-C水平則較對(duì)照組明顯降低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.05)。
　　3、對(duì)小鼠主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化病變大體觀察以及光學(xué)顯微鏡下觀察病理改變，發(fā)現(xiàn)AG組與AE組小鼠幾乎都出現(xiàn)不同程度的動(dòng)脈粥樣硬化，而對(duì)照組小鼠幾乎無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化改變。使用

10、醫(yī)學(xué)數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)對(duì)AG組、AE組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的厚度以及斑塊面積進(jìn)行定量分析顯示，兩組小鼠斑塊厚度和面積分別為:AG組:（0.095±0.013）mm，（0.075±0.015）mm2; AE組:（0.104±0.015）mm，（0.080±0.014）mm2。AG組與AE組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的厚度與斑塊面積差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，P＞0.05)。將AG組與AE組所有小鼠(n=12)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積與體內(nèi)相應(yīng)

11、的PMP中miRNA-223的相對(duì)含量進(jìn)行相關(guān)性比較，結(jié)果顯示:AG組與AE組間比較兩者之間相關(guān)性(r=0.22，P＞0.05)，AG組組內(nèi)比較(r=0.36，P＞0.05)，AE組組內(nèi)比較(r=0.06，P＞0.05)。PMP中miRNA-223的相對(duì)水平與AS斑塊面積無(wú)明顯相關(guān)性。
　　五、結(jié)論：
　　1、三組實(shí)驗(yàn)小鼠均可以成功存活，且AG組與AE組通過(guò)高脂飼養(yǎng)體內(nèi)已出現(xiàn)了不同程度的動(dòng)脈粥樣硬化改變。
　　2、AE

12、組動(dòng)脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)的PMP中miRNA-223的含量較正常對(duì)照小鼠升高;miRNA-223的轉(zhuǎn)錄合成可以被miRNA-223 antagomir所抑制，AG組小鼠體內(nèi)PMP中miRNA-223的含量明顯低于AE組和對(duì)照組小鼠。
　　3、AG組與AE組小鼠在體重、TC、TG、LDL-C、動(dòng)脈粥樣硬化病變程度上均高于對(duì)照組，HDL-C低于對(duì)照組;AG組與AE組小鼠之間體重、血脂水平以及動(dòng)脈粥樣硬化病變程度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ApoE上