新生兒缺氧缺血性腦病大鼠模型實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及臨床研究.pdf

1、第一部分、超聲技術(shù)評(píng)價(jià)新生大鼠缺氧缺血性腦病模型的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：新生兒缺氧缺血性腦病(neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy，NHIE)是新生兒在胎兒期和出生后因?yàn)橹舷⑷毖踉蛩鸬娘B腦損傷，包含出生前胎兒在宮內(nèi)的窘迫以及生后缺氧兩方面原因，是導(dǎo)致新生兒死亡和嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)功能產(chǎn)生后遺癥的主要原因，NHIE的病因十分復(fù)雜，并且病變的程度、病變開(kāi)始的時(shí)間很難及時(shí)進(jìn)行辨別，因此需要進(jìn)行

2、及時(shí)的NHIE早期診斷，有助于患兒的早期恢復(fù)，以期改善遠(yuǎn)期預(yù)后和減少殘疾。本研究通過(guò)建立新生大鼠NHIE模型，應(yīng)用二維超聲(two-dimensionalultrasound，2DUS)觀察側(cè)腦室、腦實(shí)質(zhì)的聲像圖改變，和多普勒超聲動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)大腦中動(dòng)脈（middle cerebral artery，MCA）血流參數(shù)在整個(gè)腦缺氧缺血過(guò)程中的改變程度，還應(yīng)用聲輻射力脈沖成像(acoustic radiation forceimpulse ima

3、ging，ARFI)技術(shù)評(píng)價(jià)新生大鼠模型NHIE腦損傷的組織硬度，并與腦組織病理改變進(jìn)行對(duì)比研究，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)的檢測(cè)評(píng)分，探討超聲各項(xiàng)指標(biāo)與新生大鼠不同程度NHIE模型的病理組織學(xué)改變及神經(jīng)行為學(xué)改變之間的關(guān)系。
　　方法：
　　1.制作動(dòng)物模型:選用廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心7日齡的Wistar大鼠108只，分成假手術(shù)組和兩個(gè)建模組。假手術(shù)組36只:僅使用眼科器械切開(kāi)皮膚，鈍性分離大鼠幼崽右側(cè)頸總動(dòng)脈，不予以

4、結(jié)扎，再直接進(jìn)行皮膚縫合。模型組1:缺血組36只，直接用絲線結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合傷口;模型組2:缺氧缺血組36只，用絲線結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，之后放回母鼠身邊進(jìn)行2h的恢復(fù)，再將動(dòng)物模型放入8％的氧和氮?dú)饣旌蠚怏w的缺氧箱中，持續(xù)缺氧2h后取出放回母鼠籠中飼養(yǎng)。
　　2.超聲檢查動(dòng)物模型:三組實(shí)驗(yàn)大鼠分別于術(shù)后3、12、24、48、72h進(jìn)行超聲檢查。將大鼠的頭顱固定于超聲檢查操作臺(tái)上，探頭置于頭部頂骨中線，用2DUS觀察其側(cè)腦室、腦

5、實(shí)質(zhì)的病變。應(yīng)用彩色多普勒超聲(ColorDoppler flow imaging，CDFI)和脈沖多普勒(pulsed wave Doppler，PW)技術(shù)測(cè)定雙側(cè)MCA起始端的收縮期最大血流速度（systoli velocity，Vs）、舒張期末最大血流速度（diastolic velocity，Vd）及阻力指數(shù)(resistance index，RI)。并應(yīng)用ARFI技術(shù)測(cè)量實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織內(nèi)部剪切波速度(shear wavevel

6、ocity，SWV)。
　　3.動(dòng)物模型的腦組織病理學(xué)檢查:每組隨機(jī)選取12只大鼠進(jìn)行病理組織標(biāo)本的制作及腦組織病理改變的觀察。使用HE染色觀察雙側(cè)腦組織水腫范圍、神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)，以及腦組織的出血位置和范圍。
　　4.動(dòng)物模型的神經(jīng)行為學(xué)觀察:將每組剩余的大鼠幼崽飼養(yǎng)至出生后30天進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)觀察。
　　結(jié)果：
　　1.動(dòng)物模型制模成功率:缺血組在建模過(guò)程中有4只大鼠死亡，死亡率為11.11％(4/36

7、)，建模成功率為88.89％(32/36)。缺氧缺血組在建模過(guò)程中共有6只大鼠死亡，死亡率為16.67％(6/36)，建模成功率為83.33％(30/36)。假手術(shù)組:建模過(guò)程中無(wú)大鼠死亡，建模成功率為100.00％(36/36)。
　　2.動(dòng)物模型PW檢查結(jié)果:三組大鼠模型術(shù)前MCA的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vs、Vd及RI比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。缺血組手術(shù)側(cè)MCA的Vs術(shù)前為10.62±1.28，與術(shù)后3h下降至6.80

8、±1.62相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后12h、24h、48h與其前一時(shí)間點(diǎn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，術(shù)后72h為6.15±1.51，與術(shù)后48h的7.29±1.51相比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);手術(shù)側(cè)MCA的Vd術(shù)前為3.17±0.69，與術(shù)后3h下降至3.00±0.46相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，于術(shù)后12h上升至3.44±0.65，與術(shù)后3h相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05

9、），術(shù)后24h、48h、72h數(shù)值與其前一時(shí)間點(diǎn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);手術(shù)側(cè)MCA的RI術(shù)前為0.69±0.05，與術(shù)后12h下降至0.52±0.07相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后24h、48h數(shù)值與其前一時(shí)間點(diǎn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，于術(shù)后72h下降至0.48±0.10，與其前一時(shí)間點(diǎn)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。缺氧缺血組手術(shù)側(cè)MCA的Vs術(shù)前為10.77±1.30，與術(shù)后1

10、2h下降至5.97±0.60相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后24h、48h、72h數(shù)值與其前一時(shí)間點(diǎn)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);手術(shù)側(cè)MCA的Vd術(shù)前為3.20±0.77，與術(shù)后3h上升至4.20±0.97相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，于術(shù)后12h下降至3.31±0.75，與術(shù)后3h數(shù)值相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后24h、48h、72h數(shù)值與其前一時(shí)間點(diǎn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.0

11、5);手術(shù)側(cè)MCA的RI術(shù)前為0.71±0.03，與術(shù)后3h下降至0.40±0.05相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后12h數(shù)值為0.45±0.64，與術(shù)后3h數(shù)值相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后24h、48h數(shù)值與其前一時(shí)間點(diǎn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），術(shù)后72h數(shù)值為0.47±0.06，與術(shù)后48h的0.42±0.08相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);總而言之，與缺血組對(duì)比，缺氧缺血組術(shù)后各時(shí)

12、間點(diǎn)的RI值均更低下，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.動(dòng)物模型術(shù)前、術(shù)后的腦組織SWV值:假手術(shù)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)SWV值與術(shù)前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。缺血組大鼠腦組織SWV值術(shù)前為0.86±0.22，與術(shù)后3h上升至1.34±0.12相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），術(shù)后12h、24h數(shù)值與其前一時(shí)間點(diǎn)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，術(shù)后48h上升至1.41±0.12，與術(shù)后24h相比，差異

13、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后72h與48h數(shù)值相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。缺氧缺血組大鼠腦組織SWV值術(shù)前為0.83±0.20，與術(shù)后3h的1.61±0.08相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后12h與3h數(shù)值相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，術(shù)后24h、48h數(shù)值與其前一時(shí)間點(diǎn)相比均上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后72h為1.64±0.18與術(shù)后48h的1.76±0.15相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

14、義(P＜0.05)?？偠灾?，缺氧缺血組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)SWV值與缺血組相比均更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.動(dòng)物模型腦組織HE染色病理改變:假手術(shù)組腦組織分層結(jié)構(gòu)清晰，皮質(zhì)和髓質(zhì)的邊界清楚;神經(jīng)元細(xì)胞核可見(jiàn)清楚的核仁、豐富的細(xì)胞質(zhì)和Nissl氏體。缺血組腦組織的分層結(jié)構(gòu)尚清晰，可以確定皮質(zhì)和髓質(zhì)邊界;神經(jīng)元細(xì)胞核偶可見(jiàn)核破裂，血管周圍腦細(xì)胞出現(xiàn)水腫。缺氧缺血組腦組織的分層結(jié)構(gòu)較不明顯，皮質(zhì)和髓質(zhì)的邊界不清楚;神經(jīng)元

15、細(xì)胞核偶可見(jiàn)核染色加深，細(xì)胞核不清楚，Nissl體較少，在小血管中可見(jiàn)大量紅細(xì)胞的積聚。
　　5.動(dòng)物模型神經(jīng)學(xué)測(cè)試統(tǒng)計(jì)結(jié)果:缺血組與缺氧缺血組的神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試評(píng)分與假手術(shù)組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）:曠場(chǎng)試驗(yàn)缺血組與缺氧缺血組水平得分及垂直得分均降低（水平得分:缺血組49.81±8.00，缺氧缺血組32.00±5.29，假手術(shù)組63.30±11.60;垂直得分:缺血組9.75±2.08，缺氧缺血組7.21±1.67

16、，假手術(shù)組13.50±3.0），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P＜0.05);懸吊試驗(yàn)缺血組及缺氧缺血組大鼠在玻璃棒上停留時(shí)間均小于假手術(shù)組（缺血組1.38±0.62分鐘，缺氧缺血組0.79±0.70分鐘，假手術(shù)組2.05±0.76分鐘），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);斜坡實(shí)驗(yàn)缺血組及缺氧缺血組大鼠頭部從朝下45度變?yōu)橄蛏洗笥?35度的時(shí)間均顯著慢于假手術(shù)組（缺血組4.00±0.73秒，缺氧缺血組7.79±1.63秒，假手術(shù)組2.80±0.8

17、3秒），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)得分缺血組及缺氧缺血組均大于假手術(shù)組(缺血組3.81±0.75，缺氧缺血組4.85±0.75，假手術(shù)組2.36±0.93)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。總而言之，神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)由好到差排列為:假手術(shù)組＞缺血組＞缺氧缺血組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.新生大鼠采取單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎并聯(lián)合放置缺氧箱的方法制作NHIE模型是模擬人類NHIE的可靠

18、方式。
　　2.新生大鼠模型腦內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的改變可反映出NHIE早期病變，并與病變程度相對(duì)應(yīng)，NHIE可導(dǎo)致腦組織層次結(jié)構(gòu)改變、神經(jīng)元數(shù)目減少、神經(jīng)細(xì)胞腫脹變形、出血梗死等病理變化。
　　3.ARFI技術(shù)可定量的反映出新生大鼠模型NHIE腦組織的硬度，可準(zhǔn)確評(píng)估腦損傷程度，其操作簡(jiǎn)單、安全系數(shù)高、對(duì)組織影響小。
　　4.本組新生大鼠模型可觀察到NHIE引起的神經(jīng)行為學(xué)預(yù)后不良后果，通過(guò)神經(jīng)行為學(xué)試驗(yàn)可評(píng)估其損傷程度

19、，并為臨床提供腦損傷后顱腦病變的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。
　　第二部分、超聲技術(shù)及格塞爾發(fā)育診斷量表評(píng)價(jià)新生兒缺氧缺血性腦病的臨床研究
　　目的：NHIE可能導(dǎo)致嬰兒死亡率升高以及遠(yuǎn)期不良疾病的發(fā)生。重度NHIE可導(dǎo)致嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，對(duì)于患兒的遠(yuǎn)期不良影響主要包括智力和運(yùn)動(dòng)發(fā)育受損、皮質(zhì)盲、神經(jīng)性聽(tīng)力損失、智力殘疾、腦性麻痹、癲癇和腦癱，嚴(yán)重者甚至死亡。ARFI技術(shù)可直觀得到組織硬度特性的信息，與物理觸診相似，具有較廣闊的臨床應(yīng)用

20、前景，并可幾乎適用于人體所有器官。本研究應(yīng)用超聲CDFI和PW檢測(cè)新生兒NHIE病例的MCA血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并使用ARFI技術(shù)評(píng)價(jià)腦損傷情況，并進(jìn)行超聲隨訪，與患兒格塞爾發(fā)育診斷量表(Gesell Development Diagnosis Scale，GDDS)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，為臨床早期診斷NHIE和評(píng)估預(yù)后提供基礎(chǔ)研究的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.應(yīng)用超聲檢查技術(shù)動(dòng)態(tài)觀察臨床確診NHIE患兒204例，首次檢查時(shí)間為出生

21、后3天內(nèi)，患兒均無(wú)合并先天性心臟病。正常對(duì)照組200例。
　　2.觀察指標(biāo):應(yīng)用2DUS觀察雙側(cè)腦室及腦實(shí)質(zhì)的回聲狀態(tài)。應(yīng)用彩色多普勒超聲從側(cè)囟顯示MCA起始端，運(yùn)用PW技術(shù)獲取Vs、Vd及RI參數(shù)，14天后及1個(gè)月后分別返院行顱腦超聲復(fù)查。使用ARFI技術(shù)獲得左、右側(cè)頂葉白質(zhì)區(qū)、大腦鐮部位及雙側(cè)丘腦SWV值。共有131例患兒（足月兒輕度組32例，足月兒中重度組35例，早產(chǎn)兒輕度組34例，早產(chǎn)兒中重度組30例）于出生后4周至8周內(nèi)

22、行第一次GDDS測(cè)試，并且10個(gè)月后及20個(gè)月均行GDDS復(fù)查，以發(fā)育商數(shù)(development quotient，DQ)記錄智力測(cè)試評(píng)分。
　　結(jié)果：
　　1.2DUS檢查結(jié)果:輕度組表現(xiàn)為局限于側(cè)腦室旁的腦實(shí)質(zhì)回聲增強(qiáng)聲像，與脈絡(luò)叢比較回聲低，14天后回聲恢復(fù)正常;并室管膜下出血28例，腦室內(nèi)出血15例。中重度組表現(xiàn)為腦實(shí)質(zhì)彌漫性的回聲增高，回聲可略低于或等同于脈絡(luò)叢，14天后復(fù)查腦實(shí)質(zhì)回聲72例恢復(fù)正常，24例顯示側(cè)

23、腦室擴(kuò)張聲像，6例腦實(shí)質(zhì)內(nèi)探及無(wú)回聲囊腔形成;并室管膜下出血34例，腦室內(nèi)出血20例，腦實(shí)質(zhì)出血4例。
　　2.CDFI及PW檢查結(jié)果:出生后3天內(nèi)檢測(cè)MCA的血流參數(shù)，足月兒輕度組、中重度組Vs較對(duì)照組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);輕度組、中重度組Vd與對(duì)照組相比具有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);三組RI比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。早產(chǎn)兒組輕度組、中重度組Vs與對(duì)照組相比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

24、義(P＜0.05);輕度組、中重度組Vd與對(duì)照組相比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;三組RI比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。通過(guò)繪制RI散點(diǎn)圖發(fā)現(xiàn)，足月兒中重度組RI多集中于＜0.65和＞0.75兩個(gè)范圍，早產(chǎn)兒中重度組RI多集中于＜0.60和＞0.80兩個(gè)范圍。14天后及1個(gè)月后復(fù)查各組大部分患兒血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)趨于好轉(zhuǎn)，即Vs上升，Vd上升。通過(guò)繪制各組復(fù)診時(shí)的RI散點(diǎn)圖顯示出14天復(fù)診時(shí)足月兒中重度組RI多集中于0.

25、70至0.80范圍，早產(chǎn)兒中重度組RI多集中于0.60至0.80范圍;1個(gè)月復(fù)診時(shí)足月兒中重度組RI多集中于0.65至0.75范圍，早產(chǎn)兒中重度組RI多集中于0.65至0.80范圍。
　　3.ARFI檢查結(jié)果:由于接受檢查患兒例數(shù)較少（共137例，其中輕度組40例、中重度度組42例和對(duì)照組55例），因此足月兒與早產(chǎn)兒合并分析結(jié)果。出生3天內(nèi)使用ARFI技術(shù)檢測(cè)腦組織各部位SWV值結(jié)果顯示輕度組、中重度組及對(duì)照組各組內(nèi)顱腦頂葉、丘腦

26、SWV值左、右比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。經(jīng)組間兩兩比較，中重度組頂葉、丘腦SWV值高于輕度組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），輕度組丘腦SWV值高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。其中有72例NHIE患兒（輕度組34例，中重度組38例）遵醫(yī)囑在初診14天后及1個(gè)月后分別兩次返院進(jìn)行ARFI復(fù)診測(cè)量，每次復(fù)診均再次進(jìn)行腦組織各部位SWV值的測(cè)量。結(jié)果顯示輕度組及中重度組兩次復(fù)查頂葉SWV值逐漸下降，差異有

27、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);雙側(cè)丘腦來(lái)兩次復(fù)查SWV值與初診比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。輕度組及中重度組大腦鐮SWV數(shù)值兩次復(fù)查與初診相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　4.NHIE患兒GDDS及神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)后結(jié)果:行初次超聲檢查之后，早產(chǎn)兒輕度組有1例患兒因合并重癥肺炎及敗血癥而死亡，足月兒中重度組有1例患兒因合并腎功能不全死亡，早產(chǎn)兒中重度組有2例患兒因NHIE死亡，各組間患兒死亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

28、P＞0.05)。經(jīng)過(guò)10個(gè)月及20個(gè)月患兒的發(fā)育及康復(fù)訓(xùn)練等治療措施后，各組各項(xiàng)GDDS兩次復(fù)診與初診相比DQ評(píng)分均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各組神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，20個(gè)月的DQ分?jǐn)?shù)顯示，足月兒輕度組＞早產(chǎn)兒輕度組＞足月兒中重度組＞早產(chǎn)兒中重度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.超聲CDFI及PW檢測(cè)MCA血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)能在一定程度上反映出NHI