裝載促血管再生基因的絲素支架構建及其對真皮再生的影響.pdf

1、促進微血管再生，加快血管化速度，對于提高皮膚真皮再生支架的存活率至關重要。本文將含有核定位短肽的魚精蛋白(PS)偶聯(lián)到富含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(RGD)三肽序列和組氨酸(His)的柞蠶絲素蛋白(ASF)上，構建同時具有細胞靶向性、內涵體逃逸及細胞核定位多功能的可生物降解新型陽離子化絲素(AP)。通過(AP+PEI)共包被和AP/ASF/PEI層層包被VEGF及Ang-1雙基因共表達質粒將質粒pDNA負載到絲素支架上，得到裝載促血管

2、再生基因的絲素支架。利用(AP+PEI)共包被和AP/ASF/PEI層層包被基因載體傳遞促血管再生的VEGF165-Ang-1雙基因共表達質粒原位轉染細胞，促進被轉染細胞持續(xù)、局部地分泌VEGF、Ang-1等血管再生所需的生長因子，加速支架的血管化速度，提高真皮再生支架的成活率。
　　首先，在EDC介導下，使柞蠶絲素蛋白的羧基與魚精蛋白的氨基發(fā)生偶聯(lián)反應生成酰胺鍵，建立對柞蠶絲素進行陽離子化改性的技術。測試顯示，當柞蠶絲素與魚精蛋

3、白質量比為100/10時，柞蠶絲素的Zeta電位從-5.2mV上升到+15.5mv，等電點pI從4.2變?yōu)?.7。當AP/pDNA質量比大于4/2時能將pDNA完全包裹，且復合物表面帶正電荷。
　　(AP+PEI)共包被法和AP/ASF/PEI層層包被法均能高效得包裹pDNA，并保護pDNA免受核酸酶的降解。(AP+PEI)/pDNA復合物表面Zeta電位為+20~+30mV，平均直徑分布為200~400nm。AP/ASF/PEI

4、/pDNA復合物表面Zeta電位分為+15~+25mV，平均直徑分布為400~600nm。(AP+PEI)共包被法和AP/ASF/PEI層層包被法均能介導質粒pDNA成功轉染EA.hy926細胞，并表現(xiàn)出較高的轉染效率和較低的細胞毒性。AP/ASF/PEI層層包被法的轉染效率略高于(AP+PEI)共包被法。
　　采用冷凍干燥法將(AP+PEI)/pDNA((30+10)/2)和AP/ASF/PEI/pDNA(45/45/10/2)

5、復合物裝載到絲素支架中，制備基因活性絲素支架。復合物在支架內分散良好，細胞在該支架內部正常粘附和生長。(AP+PEI)/pDNA((30+10)/2)和AP/ASF/PEI/pDNA(45/45/10/2)復合物能成功將VEGF165-Ang-1雙基因共表達質粒導入目的細胞，導入的基因能正常地表達并分泌VEGF，且隨時間的延長VEGF分泌量顯著增多。該基因活性絲素支架體外能轉染雞胚尿囊膜上的細胞，并刺激其生成豐富的血管，且血管形態(tài)呈多分

6、支的彌漫放射狀，血管數(shù)目及大小都明顯高于未裝載基因活性物質的絲素多孔材料組。
　　進一步，將該絲素基因活性支架植入SD大鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面，體內實驗結果顯示該支架炎癥反應輕微，能良好地與周圍組織融合。周圍組織及真皮修復細胞遷入材料內部，支架可引導新生組織的長入和毛細血管形成，并促進表皮成活。隨著修復時間的延長，支架內新生毛細血管和膠原纖維的生成量明顯比單純絲素多孔支架內多。在創(chuàng)面修復早期，該基因活性支架內VEGF、Ang-1、