復(fù)合生長因子和基因制備促血管再生活性支架的研究.pdf

1、隨著再生醫(yī)學(xué)/組織工程的發(fā)展,人們對支架材料的要求也不再局限于生物相容性,而要求支架具有生物活性,能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化,從而引導(dǎo)組織再生. 本文首先嘗試了用生長因子構(gòu)建活性支架.采用層層自組裝技術(shù),在TCPS表面成功地構(gòu)建了(aFGF/heparin)/PEI自組裝多層膜.體外成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果證明,aFGF 在多層膜中仍然保持一定的生物活性,可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)I型膠原和白介素6的分泌.體外PBS浸泡實驗顯示(aFGF

2、/heparin)/PEI多層膜具有一定的穩(wěn)定性,但浸泡48h后,多層膜的生物活性顯著下降,而保存在-20℃可以有效地保持多層膜的生物活性.將層層自組裝技術(shù)成功地應(yīng)用于膠原多孔支架的改性,構(gòu)建了具有生物活性的膠原支架.成纖維細(xì)胞在該支架中的MTT活性有所提高,但不顯著. 針對生長因子活性不易保持、難以控釋、價格昂貴等缺點,我們進(jìn)行了將表達(dá)生長因子的基因及其載體與組織工程支架相結(jié)合,從而構(gòu)建活性支架的探索.我們制備了N-三甲基殼聚糖

3、(TMC)和N-三甲基殼寡糖(TMO),可通過反應(yīng)時間控制其季銨化程度.TMC/TMO可與DNA通過靜電作用形成幾百納米大小的微粒,其尺寸受N/P值調(diào)控.較高的季銨化程度可以獲得較小的復(fù)合物微粒.載體與DNA的結(jié)合能力隨著季銨化程度的增加而增大,形成復(fù)合物的表面電勢亦隨之增大.載體的毒性隨季銨化程度和分子量的增加而增大.細(xì)胞對復(fù)合物微粒的吞噬量隨著 TMC的季銨化程度增加而增加,但載體的基因轉(zhuǎn)染能力隨季銨化程度增加而先增加后降低,其轉(zhuǎn)染

4、能力優(yōu)于PEI,但仍低于Lipofectamine2000. 制備了聚N-異丙基丙烯酰胺和TMC的接枝共聚物(TMC-g-PNIPAAm),其LCST 為32℃.TMC-g-PNIAAm共聚物的LCST隨鹽溶液濃度的增大而減小,但不受pH值影響.TMC-g-PNIPAAm/DNA微粒的大小在200～900nm之間,溫度對微粒粒徑的影響不顯著.微粒的表面電勢和TMC-g-PNIPAAm與DNA的結(jié)合力受溫度調(diào)控.接枝 PNIPAAm

5、 對37℃下的細(xì)胞吞噬行為沒有明顯影響.TMC-g-PNIPAAm/DNA微粒的基因轉(zhuǎn)染效率受溫度調(diào)控,降低溫度可以顯著提高TMC-g-PNIPAAm的基因轉(zhuǎn)染效率.其最佳轉(zhuǎn)染效率與Lipofectamine2000.相當(dāng),而細(xì)胞毒性則顯著低于Lipofectamine2000.以二氧化硅微粒為模型,在其表面接枝Tat多肽.Tat接枝量可由投料量控制,并且接枝Tat對微粒的物理性質(zhì)無顯著影響.發(fā)現(xiàn)Tat多肽可介導(dǎo)細(xì)胞對微粒的吞噬,同時還

6、會改變胞吞后微粒在細(xì)胞內(nèi)的分布,可將微粒導(dǎo)入細(xì)胞核區(qū).使用戊二醛可以有效地將Tat多肽接枝到TMO/DNA微粒上,通過反應(yīng)條件可控制Tat接枝量.接枝Tat多肽對TMO/DNA微粒的物理性質(zhì)和細(xì)胞毒性無顯著影響,但可顯著提高細(xì)胞吞噬量和基因轉(zhuǎn)染效率. 以表達(dá)VEGF的質(zhì)粒DNA為模型,將載體/DNA微粒通過物理吸附的方法復(fù)合到膠原支架中,結(jié)合量受微粒濃度調(diào)控.載體/DNA微粒在支架中有一定的緩釋能力.將負(fù)載載體/DNA微粒的膠原支