可再生附屬器官的基因活性皮膚再生材料構(gòu)建及性能研究.pdf

1、皮膚附屬器官的再生是皮膚組織修復(fù)與再生功能化的重要標(biāo)志之一。盡管目前商業(yè)化的人工皮膚替代物能夠?qū)崿F(xiàn)表皮和真皮的結(jié)構(gòu)性修復(fù)，但皮膚附屬器官仍然缺失。為了在表皮和真皮組織修復(fù)的同時(shí)實(shí)現(xiàn)毛囊再生，以基因工程方法，將目的基因?qū)胭|(zhì)粒，制備肝細(xì)胞生長因子質(zhì)粒DNA(HGF-pDNA)，實(shí)現(xiàn)對目的蛋白HGF的持續(xù)表達(dá)。以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)為種子細(xì)胞，制備負(fù)載BMSCs的基因活性膠原-殼聚糖支架材料(GASM)。
　　將脂質(zhì)體(Li

2、pofectamineTM2000)與pDNA利用靜電作用形成納米粒子來保護(hù)pDNA，將納米粒子導(dǎo)入膠原-殼聚糖支架，得到基因活性支架(GAS)，激光共聚焦顯微鏡(CLSM)及掃描電子顯微鏡(SEM)顯示納米粒子能夠均勻分散在支架中，并良好粘附在孔壁表面。將BMSCs種植到支架中，Western Blotting結(jié)果顯示，相對于空白支架，GAS能夠極大促進(jìn)目的蛋白HGF的表達(dá)。利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)及Wester

3、n Blotting對基因活性支架中毛囊特征因子多功能蛋白聚糖(Versican)、堿性磷酸酶(ALP)、Ⅳ型膠原(COLⅣ)分析顯示，三種信號因子在基因和蛋白水平的表達(dá)都較空白支架高，表明BMSCs被GAS誘導(dǎo)向毛囊定向分化。
　　以負(fù)載BMSC的空白支架(BSM)和HGF-pDNA GAS為對照組，將實(shí)驗(yàn)組GASM植入SD大鼠的背部全層皮膚損傷模型中。大體觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組能夠在再生表皮與真皮組織的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)毛發(fā)的再生。對1

4、0d、21 d和35 d的組織切片H&E染色分析發(fā)現(xiàn)，在10 d時(shí)可見松散的團(tuán)狀類毛囊結(jié)構(gòu)，而21 d和35 d時(shí)這種結(jié)構(gòu)逐漸成熟。為鑒定再生類毛囊結(jié)構(gòu)，對再生組織進(jìn)行免疫組化(IHC)分析發(fā)現(xiàn)，再生類毛囊結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)Versican、ALP和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)陽性，表明再生類毛囊結(jié)構(gòu)具有毛囊特征。對其進(jìn)行RT-qPCR及Western Blotting分析顯示，相對于對照組，實(shí)驗(yàn)組10 d時(shí)在Versican、ALP和α-S

5、MA因子蛋白及基因水平的表達(dá)都較高。將雄性大鼠的BMSCs作為種子細(xì)胞植入雌性體內(nèi)，采用Y染色體原位雜交的方法鑒定再生毛囊結(jié)構(gòu)細(xì)胞來源，發(fā)現(xiàn)在10 d時(shí)部分細(xì)胞呈現(xiàn)Y染色體陽性，而在21 d時(shí)陽性細(xì)胞比例急劇下降，表明植入的外源性BMSCs與自體細(xì)胞共同參與再生組織毛囊結(jié)構(gòu)的重建。
　　為了實(shí)現(xiàn)原位誘導(dǎo)再生，在不加入BMSCs的GAS中引入SDF-1，以期其能夠誘導(dǎo)自體干細(xì)胞參與毛囊再生。將合成的磺化殼聚糖(OCS)與聚賴氨酸(P