4-1BB信號在Treg中的免疫調(diào)控作用及同種異源Treg對腫瘤細(xì)胞直接效應(yīng)初步研究.pdf

1、第一部分多發(fā)性骨髓瘤患者Treg表達(dá)水平及4-1BB信號在Treg中的免疫調(diào)控作用
　　目的：
　　（1）研究多發(fā)性骨髓瘤患者Treg的表達(dá)水平
　?。?）探討4-1BB信號對Treg細(xì)胞的促增殖作用。
　　方法：
　?。?）采用免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測多發(fā)性骨髓瘤患者外周血和骨髓Treg表達(dá)；
　?。?）采用免疫磁珠法分選CD4+CD25+CD127low/-細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)測定其表面4-1BB

2、表達(dá)，同時加入IL-2后測定其4-1BB表達(dá)有無改變；
　?。?）采用免疫磁珠法富集骨髓瘤原代細(xì)胞，與同源PBMC進(jìn)行腫瘤淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，CFSE法測定阻斷4-1BB/4-1BBL信號通路后CD4+CD25high細(xì)胞的增殖改變
　　結(jié)果：
　?。?）多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Treg水平較正常對照組高，多發(fā)性骨髓瘤患者的Treg水平與臨床特征和預(yù)后無明顯相關(guān)性；
　?。?）Treg細(xì)胞表面構(gòu)成性表達(dá)4-1BB分子

3、，IL-2可上調(diào)Treg表面4-1BB表達(dá)，
　?。?）原代骨髓瘤細(xì)胞表面高表達(dá)4-1BBL分子，通過4-1BB-FC交聯(lián)4-1BBL阻斷4-1BB活化信號能夠抑制Treg增殖.
　　結(jié)論：多發(fā)性骨髓瘤患者Treg細(xì)胞表達(dá)水平上調(diào)，Treg細(xì)胞表面構(gòu)成性表達(dá)4-1BB分子，其介導(dǎo)的4-1BB正向信號可促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖，提示4-1BB信號可能為調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的干預(yù)靶點。
　　第二部分同種異源Treg對腫瘤細(xì)胞直接效應(yīng)

4、的初步研究
　　目的：探討抗原特異性的Treg細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的直接效應(yīng)
　　方法：
　　（1）分離正常供體單核細(xì)胞，以粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和重組白細(xì)胞介素(IL-4）誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得不成熟樹突狀細(xì)胞；
　　（2）以負(fù)載腫瘤抗原的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)抗原特異性 Treg體外生成和擴(kuò)增
　?。?）把抗原特異性Treg與骨髓瘤細(xì)胞系進(jìn)行體外共培養(yǎng)，采用Annexin-V/PI染色法測定骨髓瘤細(xì)胞凋亡

5、水平有無改變，采用CFSE測定骨髓瘤細(xì)胞增殖是否受抑，采用細(xì)胞內(nèi)因子染色法測定骨髓瘤細(xì)胞合成IL-6水平有無改變，
　?。?）測定活化后CD95L在Treg表面有無上調(diào).
　　結(jié)果：
　　（1）通過形態(tài)和表型特征鑒定證實培養(yǎng)所得不成熟樹突狀細(xì)胞；
　　（2）采用樹突狀細(xì)胞能夠誘導(dǎo)Treg體外擴(kuò)增，7天后擴(kuò)增效率達(dá)10倍
　　（3）擴(kuò)增所得抗原特異性Treg能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，細(xì)胞內(nèi)因子染色提示