新型PDK1抑制劑對多發(fā)性骨髓瘤的殺傷作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 PDK1抑制劑GSK2334470單藥及聯(lián)合mTOR抑制劑PP242的抗骨髓瘤作用研究
　　目的:
　　研究PDK1抑制劑GSK-470的抗骨髓瘤作用及其分子機(jī)制;通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，探討GSK2334470協(xié)同mTOR抑制劑PP242抑制骨髓瘤細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)制。
　　方法:
　　采用MTT法檢測GSK2334470和/或PP242對多發(fā)性骨髓瘤(multiplymyeloma，MM)細(xì)胞

2、株和患者原代細(xì)胞的生長抑制作用;流式細(xì)胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡;Western blot檢測Caspase-3/8/9、PARP、PI3K/PDK1/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。構(gòu)建RPMI8226細(xì)胞荷瘤小鼠模型，檢測GSK2334470和/或PP242對小鼠瘤體生長的影響。
　　結(jié)果:
　　1.GSK2334470可以抑制骨髓瘤細(xì)胞株及原代MM患者細(xì)胞生長，呈濃度依賴性;對正常細(xì)胞株無明顯

3、毒性作用。
　　2.外源性IL-6和IGF-1不能逆轉(zhuǎn)GSK2334470對骨髓瘤細(xì)胞株的殺傷作用。
　　3.GSK2334470可以誘導(dǎo)MM細(xì)胞株和原代細(xì)胞發(fā)生凋亡，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和PARP被激活。
　　4.GSK2334470通過抑制PDK1的磷酸化來調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR通路及其下游蛋白。
　　5.GSK2334470可以協(xié)同PP242殺傷骨髓瘤細(xì)胞株和原

4、代細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　6.PP242通過抑制mTORC2、下調(diào)Akt第473位點(diǎn)上絲氨酸的磷酸化來增強(qiáng)GSK2334470的抗骨髓瘤作用，兩者聯(lián)用完全抑制了Akt和mTORC1/C2的活性。
　　7.GSK2334470、PP242均可抑制MM荷瘤小鼠瘤體的生長，但聯(lián)合組的抑制作用更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;聯(lián)合組瘤體的mTORC1和mTORC2的活性都有明顯下降。
　　第二部分 PTEN在PDK1抑制劑GSK23

5、34470抗骨髓瘤作用中的重要性研究
　　目的:
　　研究和比較GSK2334470對四種MM細(xì)胞株殺傷作用的差異及其與PTEN基因的關(guān)系;通過腺病毒或藥物改變骨髓瘤細(xì)胞中PTEN蛋白的水平來進(jìn)一步證實(shí)PTEN在GSK2334470抗骨髓瘤作用中重要性;研究GSK2334470與蛋白酶體抑制劑MG132的協(xié)同抗骨髓瘤作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　采用MTT法檢測生長抑制作用;流式細(xì)胞儀AnnexinⅤ/PI雙染

6、法檢測細(xì)胞凋亡;PCR和Western b1ot檢測MM細(xì)胞株P(guān)TEN的本底表達(dá);腺病毒轉(zhuǎn)染使MM細(xì)胞株過表達(dá)或低表達(dá)PTEN;Western blot檢測胞漿PTEN、胞核PTEN及PI3K/PDK1/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。激光共聚焦檢測PTEN蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布。
　　結(jié)果:
　　1.GSK2334470對四種骨髓瘤細(xì)胞殺傷作用有明顯的差異，對ARP-1和MM.1R較敏感;ARP-1、MM.1R凋亡細(xì)胞

7、比例也明顯高于RPMI8226和OPM-2;與細(xì)胞株的PTEN表達(dá)呈正相關(guān)。
　　2.通過腺病毒轉(zhuǎn)染改變MM細(xì)胞株P(guān)TEN的表達(dá)，可改變GSK2334470的敏感性。
　　3.MG132通過增加細(xì)胞中PTEN的表達(dá)，調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR通路及其下游蛋白，協(xié)同GSK2334470殺傷骨髓瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)凋亡。
　　4.GSK2334470可以使MM細(xì)胞株胞漿中高表達(dá)的PTEN向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，明確了GSK2334470

8、抗骨髓瘤作用的其他機(jī)制，與MG132協(xié)同抗骨髓瘤的分子機(jī)制。
　　結(jié)論:
　　GSK2334470通過抑制PDK1的磷酸化來調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR通路，誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡;mTOR抑制劑PP242通過抑制mTORC2和p-Akt S473的磷酸化協(xié)同GSK2334470發(fā)揮抗骨髓瘤作用。GSK2334470的敏感性與MM細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達(dá)水平有關(guān);可通過蛋白酶體抑制劑MG132或腺病毒轉(zhuǎn)染增加細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達(dá)提