染料木黃酮通過Akt-NF-κB通路增敏吉西他濱抑制骨肉瘤增殖和誘導(dǎo)凋亡的研究.pdf

1、骨肉瘤(osteosarcoma)是兒童和青少年最常見的起源于間充質(zhì)細(xì)胞的惡性骨腫瘤，目前采用新輔助化療、保肢手術(shù)等綜合治療方案后，療效有了顯著提高，5年生存率達(dá)到65％～75％，但復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者5年生存率仍低于20％;對(duì)于復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的治療，目前匱乏有效手段，預(yù)后極差，骨肉瘤化療過程中腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，抑制凋亡，導(dǎo)致惡性增殖，是其治療失敗的重要原因。因此，尋找有效的耐藥逆轉(zhuǎn)劑或化療增敏劑是目前亟需解決的關(guān)鍵

2、問題。
　　吉西他濱(Gemcitabine)是一種嘧啶核苷類似物，屬于抗代謝類抗癌藥，已應(yīng)用于骨肉瘤的實(shí)驗(yàn)及臨床研究。它主要作用于DNA合成期和G1后期，可阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而使細(xì)胞停滯于G1/S期。吉西他濱在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)核苷激酶作用轉(zhuǎn)化成具有活性的代謝產(chǎn)物。并且，吉西他濱本身還可增強(qiáng)核苷激酶活性，起到自我增效的作用。研究報(bào)道，吉西他濱的單藥化療，療效不盡人意，可能與吉西他濱激活NF-κB通路，促進(jìn)腫瘤增殖和抑制凋亡，導(dǎo)致

3、腫瘤耐藥相關(guān)。因此，抑制腫瘤的增殖和誘導(dǎo)凋亡，探討利用非細(xì)胞毒藥物來增敏化療藥物療效，給骨肉瘤的治療帶來新的曙光。
　　黃酮類化合物(Flavonoid compounds)是一類多酚化合物，具有一個(gè)共同的碳架結(jié)構(gòu)(C6-C3-C6)，其中心結(jié)構(gòu)是2-苯基-1，4-苯并吡喃酮，能夠降低腫瘤的發(fā)病率，更為重要的是其可以誘導(dǎo)腫瘤的凋亡。研究表明，染料木黃酮(Genistein)具有良好的抗腫瘤作用，能夠抑制Akt/NF-κB通路，通過

4、抑制腫瘤增殖和誘導(dǎo)凋亡來增敏化療藥物療效。
　　Akt/NF-κB通路介導(dǎo)的腫瘤耐藥機(jī)制是多方面的，抑制凋亡可能是其重要因素，其可能機(jī)制如下:1）NF-κB細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng);2）誘導(dǎo)抗凋亡基因Bcl-XL、Bcl-2的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡;3）促進(jìn)凋亡蛋白因子Survivin的表達(dá)，直接抑制效應(yīng)分子caspase-7、caspase-3特異性結(jié)合，從而抑制凋亡的發(fā)生;4）促進(jìn)環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase，CO

5、X)的表達(dá)，介導(dǎo)腫瘤增殖和凋亡抑制。綜上，Akt/NF-κB通路主要通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腫瘤耐藥的產(chǎn)生。因此，Akt/NF-κB通路很可能是腫瘤治療中的有效靶點(diǎn)。
　　鑒于吉西他濱在骨肉瘤治療中的耐藥及染料木黃酮的藥物增敏作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了藥物聯(lián)合作用的課題，本課題將主要通過以下兩方面內(nèi)容來研究:第一部分，以骨肉瘤細(xì)胞系為研究對(duì)象，闡明染料木黃酮增敏吉西他濱抑制骨肉瘤增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用及機(jī)制。第二部分，建立經(jīng)原位種植的骨肉瘤細(xì)

6、胞小鼠模型，以病理組織學(xué)方法結(jié)合細(xì)胞免疫化學(xué)染色法研究染料木黃酮和/或吉西他濱作用后，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，并檢測(cè)信號(hào)通路，驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　第一部分:染料木黃酮增敏吉西他濱抑制骨肉瘤增殖和誘導(dǎo)凋亡的體外研究
　　目的:研究染料木黃酮增敏吉西他濱抑制骨肉瘤增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用及機(jī)制。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、染料木黃酮(20μmol/L)組、吉西他濱(0.5μmol/L)組、藥物聯(lián)合4組。通過細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(

7、MTT)測(cè)定對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系的增殖抑制效果;應(yīng)用電鏡來觀察藥物作用后骨肉瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;通過DNA Ladder和TUNEL檢測(cè)凋亡現(xiàn)象;流式細(xì)胞儀分析凋亡變化;通過RT-PCR、Western blot及免疫共沉淀檢測(cè)相關(guān)蛋白變化。
　　結(jié)果:藥物聯(lián)合組可顯著抑制MG-63、U2OS、MNNG/HOS細(xì)胞增殖，可見特征性的DNA ladder條帶，且凋亡率明顯增高。吉西他濱可誘導(dǎo)各細(xì)胞系NF-κB激活，促進(jìn)骨肉瘤增殖和抑制凋亡

8、。而藥物聯(lián)合組明顯降低p-Akt、NF-κB、bcl-2、Bcl-xL、COX-2、survivin等的表達(dá)。
　　結(jié)論:染料木黃酮可通過Akt/NF-κB通路增敏吉西他濱抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡。
　　第二部分:染料木黃酮增敏吉西他濱抑制骨肉瘤小鼠腫瘤增殖和誘導(dǎo)凋亡的體內(nèi)研究
　　目的:研究染料木黃酮增敏吉西他濱抑制骨肉瘤小鼠腫瘤增殖的作用及機(jī)制。
　　方法:骨肉瘤細(xì)胞MNNG/HOS注射于BALB/c小

9、鼠皮下，建立原位骨肉瘤細(xì)胞小鼠模型。在骨肉瘤細(xì)胞種植后5天，將小鼠隨機(jī)分為4組，每組6只。第一組為對(duì)照組;第二組為吉西他濱組，吉西他濱80mg/kg隔天腹腔內(nèi)注射;第三組為染料木黃酮組，以染料木黃酮1 mg/天給予每只小鼠灌胃，連續(xù)口服10天;第四組為藥物聯(lián)合組，即言西他濱與染料木黃酮共同作用。所有小鼠在藥物處理后3天后處死，取腫瘤組織并稱重。采用腫瘤體積重量觀察、解剖觀察及組織學(xué)染色檢查原發(fā)病灶。以病理組織學(xué)HE染色方法檢測(cè)骨肉瘤凋亡

10、現(xiàn)象;原位TUNEL檢測(cè)骨肉瘤凋亡;結(jié)合細(xì)胞免疫化學(xué)染色法檢測(cè)NF-κB及Bcl-xL表達(dá)變化;并通過腫瘤組織Western blot和免疫共沉淀檢測(cè)p-Akt、NF-κB表達(dá)，即驗(yàn)證體外的抗腫瘤途徑。
　　結(jié)果:藥物聯(lián)合能夠明顯降低腫瘤的體積和重量，誘導(dǎo)腫瘤凋亡，NF-κB及Bcl-xL表達(dá)明顯下降(p＜0.0001)。吉西他濱可誘導(dǎo)NF-κB激活;而與染料木黃酮聯(lián)合可明顯抑制NF-κB表達(dá)，并且p-Akt表達(dá)顯著降低。