慢性腎衰竭情況下膽汁酸代謝的臨床及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的:
　　膽汁酸是肝臟合成的對(duì)食物中脂肪及脂溶性維生素的乳化、消化、吸收起重要作用的物質(zhì)。除了小部分的膽汁酸隨糞便排出體外從而丟失，大部分進(jìn)入腸道的膽汁酸會(huì)在回腸被主動(dòng)吸收進(jìn)入門脈系統(tǒng)。門靜脈內(nèi)的膽汁酸會(huì)被肝臟重新攝取，完成腸肝循環(huán)。肝臟合成的膽汁酸主要用來(lái)補(bǔ)充糞便途徑丟失，膽汁酸腸肝循環(huán)在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)膽汁酸從頭合成途徑起重要調(diào)節(jié)作用。通常認(rèn)為，除了膽汁淤積等一些特殊情況下，腎臟對(duì)膽汁酸的濾過(guò)、重吸收及分泌作用對(duì)膽汁酸的代謝

2、及平衡幾乎沒(méi)有影響。在健康人群中，膽汁酸通過(guò)腎臟途徑的代謝量可以忽略不計(jì)。
　　腎臟主要作用是排出代謝產(chǎn)物、維持體內(nèi)水及電解質(zhì)平衡、調(diào)節(jié)血脂代謝、調(diào)節(jié)血壓、分泌及降解激素、產(chǎn)生和利用體循環(huán)中葡萄糖，因此腎臟在維持體內(nèi)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起到重要作用。隨著慢性腎臟病進(jìn)行性、慢性進(jìn)展，腎單位逐漸減少，腎功能不可逆下降，繼而出現(xiàn)代謝產(chǎn)物和毒物滯留，水電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂以及內(nèi)分泌失調(diào)，最終導(dǎo)致慢性腎衰竭。然而近年來(lái)的研究表明，當(dāng)腎臟功能受到損害

3、時(shí)，不僅會(huì)出現(xiàn)以上所述高血壓、碳水化合物及脂肪代謝紊亂等常見(jiàn)的表現(xiàn)，還會(huì)導(dǎo)致血漿膽汁酸水平增高及膽汁酸代謝紊亂。
　　為了找到腎衰竭環(huán)境下血漿膽汁酸水平增高及膽汁酸代謝紊亂的原因，人們已經(jīng)進(jìn)行了許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，腎衰竭動(dòng)物模型中的肝臟膽汁酸合成限速酶一膽固醇7α-羥化酶活性與正常對(duì)照組無(wú)明顯變化，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明在腎衰竭動(dòng)物模型中，肝臟膽汁酸合成速度無(wú)明顯變化。
　　然而以上研究只是證明在腎哀竭動(dòng)物模型中膽

4、汁酸從頭合成途徑未受到影響，沒(méi)有測(cè)定膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，也缺乏臨床相關(guān)研究資料，因此沒(méi)有找到血漿膽汁酸水平增高及膽汁酸代謝紊亂的真正原因。本研究的目的就是找出腎衰竭環(huán)境下可能影響膽汁酸代謝的因素。另外本研究是首次從動(dòng)物模型及臨床兩個(gè)方面對(duì)腎衰竭條件下膽汁酸代謝情況進(jìn)行系統(tǒng)研究。
　　材料和方法:
　　1.動(dòng)物模型
　　適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后采用完全隨機(jī)化方法進(jìn)行分組。首先將動(dòng)物按照體重大小編號(hào)，從隨機(jī)數(shù)字表中任一行開(kāi)始抄取

5、48個(gè)隨機(jī)數(shù)字，如遇相同數(shù)字，抄取下一個(gè)隨機(jī)數(shù)字。對(duì)隨機(jī)數(shù)字按照從小到大排序，排序后規(guī)定前16個(gè)為腎衰竭組，后16個(gè)為假手術(shù)組，中間16個(gè)為單側(cè)腎切除組。
　　采用文獻(xiàn)中介紹的手術(shù)方法制作腎衰竭、單側(cè)腎切除及假手術(shù)組模型。腎衰竭組實(shí)施5/6腎切除，首先切除2/3左側(cè)腎組織，1周后切除整個(gè)右腎。單側(cè)腎切除組第一次手術(shù)時(shí)僅分離腎臟包膜，假手術(shù)組大鼠兩次手術(shù)都僅分離腎臟包膜。所有大鼠術(shù)后應(yīng)用青霉素預(yù)防感染。
　　所用動(dòng)物在禁食過(guò)夜

6、條件下采眼底靜脈血4次，分別為手術(shù)開(kāi)始前1天，手術(shù)實(shí)施后2周、4周、6周，實(shí)驗(yàn)8周處死動(dòng)物時(shí)心臟穿刺取血。得到血漿后-80℃凍存。實(shí)驗(yàn)8周時(shí)處死動(dòng)物，無(wú)菌手術(shù)打開(kāi)腹腔，摘除肝臟、腎臟、回腸備用。分別于手術(shù)開(kāi)始前及大鼠處死前24小時(shí)將大鼠置入代謝籠中，收集24小時(shí)尿液，-80℃冰箱凍存。
　　2.動(dòng)物生化指標(biāo)檢測(cè)
　　血漿總膽固醇及肌酐水平采用自動(dòng)生化儀測(cè)量。血漿總膽汁酸采用生化試劑盒測(cè)量。結(jié)合膽汁酸及游離膽汁酸測(cè)定采用高效液

7、相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法。尿蛋白濃度測(cè)定采用生化試劑盒測(cè)量。
　　3.分離培養(yǎng)近端腎小管上皮細(xì)胞及FXR信號(hào)通路檢測(cè)
　　將從腎組織中得到的近端腎小管上皮細(xì)胞在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中做原代培養(yǎng)，向培養(yǎng)成功的細(xì)胞中加入FXR基因激動(dòng)劑，通過(guò)RT-PCR及蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測(cè)FXR信號(hào)通路完整性。
　　4.RT-PCR及蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測(cè)組織中各種膽汁酸代謝相關(guān)蛋白及相關(guān)基因表達(dá)情況
　　檢測(cè)項(xiàng)目有:大鼠肝臟膽汁酸合成

8、限速酶Cy8b1及Cyp7a1mRNA水平;大鼠肝臟Cyp7a1蛋白表達(dá);大鼠肝臟Bsep， Ntcp，Slcoa1，Mrp3，Mrp4，Ost-α，F(xiàn)xr以及Shp mRNA水平;大鼠肝臟Bsep，Ntcp，Slcoa1， Mrp2， Mrp3以及Ost-α蛋白質(zhì)表達(dá);大鼠腎臟ASBT，Slcoa1，Mrp3，Mrp4，Ost-α，Ost-β，F(xiàn)xr以及Shp mRNA水平;大鼠腎臟Asbt，Mrp3以及Ost-α蛋白質(zhì)表達(dá);大鼠回腸

9、ASBT，Mrp3，Ost-α，Ost-β mRNA水平;大鼠回腸ASBT，Mrp3，Ost-α蛋白質(zhì)表達(dá);人類腎臟ASBT，Mrp2，Ost-α，Ost-β mRNA水平;人類腎臟ASBT，Mrp2，Ost-α蛋白質(zhì)表達(dá)。
　　5.臨床資料的收集
　　共收集了兩組病例資料。一組均為腎衰竭患者，61例，將34例患有良惡性腫瘤，需要接受單側(cè)腎切除患者納入對(duì)照組。所有對(duì)照組患者在手術(shù)前完成了血液及尿液樣本收集。腎衰竭組的腎臟組織

10、標(biāo)本來(lái)源于腎臟穿刺活檢，對(duì)照組標(biāo)本來(lái)源于切除腎臟組織，選取遠(yuǎn)離腫瘤部位腎皮質(zhì)取材。
　　6.血液標(biāo)本及尿液標(biāo)本生化指標(biāo)測(cè)定
　　采用日立7600全自動(dòng)生化儀測(cè)量谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、血糖、膽固醇、甘油三酯等生化指標(biāo)。第五代循環(huán)酶速率法測(cè)定血液及尿液標(biāo)本中總膽汁酸濃度。
　　7.腎臟組織病理檢查
　　病理標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)切片，分別常規(guī)進(jìn)行HE、MASSON染色。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠生化指標(biāo)改變

11、
　　與假手術(shù)組相比，慢性腎衰竭大鼠血漿肌酐濃度明顯升高，計(jì)算腎小球率過(guò)濾明顯降低，表明模型建造成功。除此之外，與假手術(shù)組相比，腎衰竭組表現(xiàn)出輕度的蛋白尿，膽固醇濃度明顯升高。與此同時(shí)，腎衰竭動(dòng)物組血漿總膽汁酸水平明顯升高。在高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法中的到的數(shù)據(jù)可以看出，每一種膽汁酸幾乎都有兩倍以上的升高，比如CA，CDCA，MCA，HDCA，尤其是非結(jié)合膽汁酸更為明顯。而6-羥基膽汁酸，比如MCA和HDCA的比率和假手術(shù)組無(wú)明顯

12、差異。
　　2.腎衰竭對(duì)肝臟膽汁酸生成限速酶的影響
　　兩組中7α-羥化酶的表達(dá)在mRNA及蛋白質(zhì)水平上都無(wú)明顯差異。而且在對(duì)一種膽酸合成酶Cyp8b1的mRNA表達(dá)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)腎衰竭組和假手術(shù)組基本無(wú)差別。
　　3.腎衰竭對(duì)肝臟、回腸、腎臟中膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)情況的影響
　　腎衰竭組大鼠肝臟基底側(cè)膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在mRNA及蛋白質(zhì)水平均無(wú)明顯差異，然而基底側(cè)膽汁酸輸出蛋白Mrp3，Ost-α，Ost-β的mRN

13、A水平明顯增高，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明Mrp3，Ost-α在蛋白質(zhì)水平上表達(dá)升高。在肝臟的毛細(xì)膽管側(cè)，膽汁酸輸出蛋白的表達(dá)與假手術(shù)組無(wú)明顯差異。
　　由于Mrp3，Ost-α以及Ost-β都是Fxr基因的靶向基因，而Fxr基因可以被膽汁酸激活，因此我們又對(duì)腎衰竭組、假手術(shù)組中的Fxr基因以及其下游的Shp基因進(jìn)行了對(duì)比。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)兩組中Fxr基因、Shp基因的mRNA水平無(wú)明顯差異。Shp基因的表達(dá)與7α-羥化酶基因表達(dá)情況

14、一致，表明血漿中高膽汁酸水平并沒(méi)有對(duì)肝臟膽汁酸的從頭合成途徑進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)。
　　在肝臟中出現(xiàn)的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)改變并沒(méi)有出現(xiàn)在回腸及殘余的116腎臟組織中。Fxr基因以及Shp基因的表達(dá)情況也在回腸、腎臟組織中進(jìn)行了檢測(cè)，同樣，腎衰竭組與假手術(shù)組間無(wú)明顯差別，表明Fxr信號(hào)途徑在腎衰竭組中并沒(méi)有被激活。
　　4.FXR基因激動(dòng)劑對(duì)腎衰竭大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞中FXR的靶向基因的影響
　　將含有以上實(shí)驗(yàn)得到的大鼠近端

15、腎小管上皮細(xì)胞中加入FXR基因激動(dòng)劑后FXR基因的靶向基因Shp和Mrp2的mRNA水平明顯升高，與此同時(shí)，F(xiàn)XR基因表達(dá)水平無(wú)明顯變化。膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ost-α和Ost-β的mRNA表達(dá)水平明顯升高，Slco1a1的mRNA表達(dá)水平降低。FXR基因信號(hào)通路在腎衰竭情況下仍然保持完整有效，刺激FXR基因信號(hào)通路會(huì)對(duì)近端腎小管上皮細(xì)胞中膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響。
　　5.單側(cè)腎切除對(duì)肝腎及腎臟膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響
　　單側(cè)

16、腎切除大鼠血漿總膽汁酸水平也會(huì)升高，與此同時(shí)，肝臟膽汁酸合成限速酶7α-羥化酶的表達(dá)無(wú)明顯改變。肝臟基底側(cè)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ost-α和Ost-β的mRNA表達(dá)水平升高，而殘留腎臟中膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白較對(duì)照組無(wú)明顯差異。
　　6.腎衰竭組及對(duì)照組患者血漿生化指標(biāo)及尿膽汁酸水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果
　　在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，血漿總膽汁酸、肌酐、甘油三酯水平較對(duì)照組升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這種生化指標(biāo)的改變符合腎衰竭患者的一般規(guī)律。谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)

17、氨酶、膽固醇在、血糖水平在兩組中的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腎衰竭組尿中總膽汁酸濃度與對(duì)照組間無(wú)明顯差別，然而腎衰竭組24h尿量較對(duì)照組明顯減少，因此24h尿膽汁酸總量明顯減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　7.腎臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果
　　在腎衰竭組，我們看到腎小球系膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化、腎血管硬化等病理改變。
　　8.腎小球?yàn)V過(guò)率及其與血漿總膽汁酸水平的關(guān)系
　　兩組中估算的腎小球?yàn)V過(guò)率有明顯差

18、異:在腎衰竭組中，通過(guò)公式計(jì)算出的腎小球?yàn)V過(guò)率平均值為27.56ml/min/1.73m2，對(duì)照組計(jì)算出的腎小球?yàn)V過(guò)率平均值為100.44ml/min/1.73m2。皮爾森相關(guān)分析計(jì)算出血漿總膽汁酸水平與腎小球率過(guò)濾之間是相關(guān)的。而在對(duì)照組中，血漿總膽汁酸水平與腎小球率過(guò)濾之間無(wú)相關(guān)關(guān)系。
　　9.腎衰竭患者腎臟組織中膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)情況
　　腎衰竭組膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與對(duì)照組在轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯差異，在蛋白質(zhì)水平上也無(wú)明顯差異。

19、
　　結(jié)論:
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明腎衰竭以及單側(cè)腎切除都能夠?qū)е卵獫{總膽汁酸水平升高，因此血漿總膽汁酸水平升高在腎臟功能受到損害的初期就能表現(xiàn)出來(lái)。本次腎衰竭模型試驗(yàn)中觀察到，膽汁酸從頭合成途徑未受到影響，肝臟細(xì)胞基底側(cè)Mrp3，Ost-α，Ost-β基因表達(dá)增強(qiáng)。這可能是對(duì)腎衰竭環(huán)境產(chǎn)生的反應(yīng)，通過(guò)提高血漿總膽汁酸水平向其他組織中傳導(dǎo)信號(hào);或者是肝臟對(duì)腎衰竭環(huán)境的一種自我保護(hù)機(jī)制，使膽汁酸更容易從肝臟細(xì)胞基底膜側(cè)排出肝臟。