一個新的MPL基因異常剪接體MPLL391-V392ins12的鑒定及在骨髓增殖性腫瘤中的突變分析.pdf

1、目的：
　　以不同方法對新發(fā)現(xiàn)的MPLL391-V392ins12異常剪接體進行鑒定，以證實其真實存在性；在骨髓增殖性腫瘤（MPN）患者中分析其突變發(fā)生情況，并與JAK2V617F、MPLexon10、CALR突變的患者比較來探討其臨床意義。
　　方法：
　　1、MPLL391-V392ins12剪接體的鑒定
　　對目的RNA進行逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)，擴增MPL基因CDS序列，凝膠回收擴增產物，酶切

2、后連接到T-載體中，轉化DH5a感受態(tài)細胞，涂板，挑取菌落，堿性裂解法提取質粒，測序鑒定。針對剪接體的序列在不同位置設計引物進行PCR擴增，兩對引物的擴增產物分別經聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀對電泳結果進行掃描分析。
　　2、MPLL391-V392ins12剪接體在MPN中突變情況分析
　　收集MPN患者、正常人、其他血液腫瘤的骨髓或外周血標本，以及實體瘤細胞株，提取基因組總RNA，將總RNA逆轉錄為cDN

3、A；對cDNA進行等位基因特異性聚合酶鏈反應(AS-PCR)擴增，經瓊脂糖凝膠電泳進行結果分析，檢測其在PV、ET、PMF中的突變情況。收集僅攜帶單一突變 MPLL391-V392ins12、JAK2V617F、MPLexon10、CALR陽性的ET、PMF患者的實驗室檢查指標，分別兩兩進行統(tǒng)計學比較分析。
　　結果：
　　1、通過克隆測序，發(fā)現(xiàn)MPL基因存在一種新的轉錄產物，即MPL基因的第7和8外顯子之間保留了36bp的

4、內含子序列，導致蛋白編碼序列氨基酸位點391與392之間插入12個氨基酸（谷、甘、亮、賴、亮、亮、脯、丙、天冬、異亮、脯、纈），故命名為MPLL391-V392ins12。根據(jù)MPLL391-V392ins12剪接體的序列設計不同引物進行PCR擴增，結果均得到該剪接體產物，說明了MPLL391-V392ins12的真實存在性。
　　2、248例MPN患者中檢測到19例存在MPLL391-V392ins12突變(總突變率7.66％)

5、，其中PV1例,突變率1.92%(1/52)；ET14例,突變率9.66%(14/145)；PMF4例，突變率7.84%(4/51)；200例正常人群中未檢測到突變；71例CML患者中檢測到2例為陽性，其余腫瘤中均未檢測到該剪接體。
　　3、MPLL391-V392ins1突變和MPLexon10突變的ET患者性別、年齡、白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)及血紅蛋白差異均無統(tǒng)計學意義（ P值均>0.05）；MPLL391-V392ins12突

6、變的ET患者年齡、白細胞計數(shù)低于JAK2V617F突變患者（P<0.05），血小板計數(shù)低于CALR突變患者（P<0.05）；MPLexon10突變的ET患者年齡、白細胞計數(shù)及血紅蛋白低于JAK2V617F突變患者（P<0.05），血紅蛋白低于CALR突變患者（P<0.05）；JAK2V617F突變的ET患者白細胞計數(shù)、血紅蛋白高于CALR突變患者（ P<0.05）。MPLL391-V392ins12突變的 PMF患者年齡小于JAK2V6

7、17F突變患者（P<0.05）；JAK2V617F突變的PMF患者白細胞計數(shù)高于CALR突變患者（P<0.05）。
　　結論：
　　1、本研究發(fā)現(xiàn)了MPL基因一個新的異常剪接體MPLL391-V392ins12，經查閱文獻，目前尚無報道。病例篩查進一步證實MPLL391-V392ins12剪接體在三種經典MPN中均可發(fā)生突變，且主要見于ET、PMF，可能是MPN發(fā)病的潛在原因之一。
　　2、ET患者中，MPLL391-