Ca2+介導紅景天苷誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元細胞定向分化的機制研究.pdf

1、目的：研究紅景天苷誘導小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向神經(jīng)細胞定向分化的過程中，Ca2+信號相關(guān)蛋白及基因的表達情況，探討紅景天苷誘導BMSCs向神經(jīng)細胞定向分化的作用及分子機制，為BMSCs用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的思路和方法，為中醫(yī)“腎生髓”理論提供分子生物學實驗依據(jù)。
　　方法：培養(yǎng)小鼠BMSCs系D1細胞至80％融合，將細胞分為對照組和紅景天苷誘

2、導組，對照組采用D/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，誘導組使用100mg·L-1紅景天苷分別作用細胞12，24，48和72h：①MTT法檢測D1細胞誘導前后的增殖率；②免疫熒光染色法標記細胞骨架蛋白β-Tubulin，觀察細胞的形態(tài)變化；③熒光免疫細胞化學染色法檢測誘導前后各組細胞神經(jīng)元標志分子神經(jīng)元特異性烯醇化酶（Neuron-specific enolase，NSE）、微管相關(guān)蛋白2（Microtubule associated prot

3、ein2，MAP2）和β-TubulinⅢ（β-微管蛋白Ⅲ）的表達。
　　將D1細胞分為對照組和誘導組，誘導1組使用不同濃度紅景天苷(5，10，20，50和100 mg·L-1)分別誘導細胞24h，誘導2組使用100mg·L-1紅景天苷分別誘導D1細胞12，24，48和72h：①Western blot方法檢測誘導前后MAP2蛋白的表達情況；②使用Ca2+染色劑Fluo-3/AM負載細胞，觀察細胞內(nèi)Ca2+熒光強度的變化；③Wes

4、tern blot方法檢測Ca2+/CaM信號通路中關(guān)鍵分子鈣調(diào)蛋白（ Calmodulin， CaM）、鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（Calmodulin dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）蛋白表達水平。
　　使用Ca2+信號特異性阻斷劑：乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸[（ Ethylene Glycol-bis-(β-Aminoethyl)–N，N，N，N-Tetraacetic Acid，EGT

5、A]、硝苯地平（Nifedipine）和PI3K抑制劑（LY294002），按不同方法作用D1細胞24h，采用Western blot方法檢測不同阻斷劑作用細胞前后CaM和NSE蛋白的表達。
　　紅景天苷分別作用D1細胞12，24和48h后，運用PCR-array技術(shù)檢測誘導前后cAMP/Ca2+信號通路中84個Ca2+相關(guān)基因mRNA的表達，從中篩選出表達差異較顯著的基因進行分析，運用Western blot方法對其中上調(diào)基因P

6、tgs-2的蛋白表達進行檢測。
　　結(jié)果：
　?。?）細胞形態(tài)學染色結(jié)果顯示：空白對照組細胞呈多角形或紡錘形，紅景天苷誘導D1細胞24h時，可見部分細胞伸出突起，胞體變大；誘導48h時細胞具有典型的神經(jīng)細胞樣特征，突起細長、胞體變小，部分細胞突起連接成類似神經(jīng)網(wǎng)絡的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
　?。?）MTT實驗結(jié)果顯示：紅景天苷誘導D1細胞12、24、48和72h后，與空白對照組比較，48、72 h誘導組細胞增殖活性降低，差異具有統(tǒng)

7、計學意義(P<0.05)，說明紅景天苷誘導后期可抑制D1細胞增殖而促進其分化。
　　（3）熒光免疫細胞化學染色結(jié)果顯示：紅景天苷誘導D1細胞12、24、48和72h后，與空白對照組比較，紅景天苷誘導組NSE、MAP2和β-TubulinⅢ蛋白陽性率顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)。
　?。?）激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示：不同濃度紅景天苷誘導BMSCs后，Ca2+熒光強度變化不同，100mg·L-1

8、紅景天苷誘導組與空白對照組BMSCs和其它各誘導組比較顯著增強，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；同一濃度紅景天苷誘導BMSCs不同時間后，48h誘導組Ca2+熒光強度較高，與其它各誘導組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　（5）Western blot實驗結(jié)果顯示：與空白對照組比較，隨著紅景天苷誘導劑量的增加MAP2蛋白表達量逐漸上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)，同一質(zhì)量濃度紅景天苷誘導D1細胞

9、24、48h時與空白對照組比較MAP2蛋白表達量顯著升高，說明紅景天苷可誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞分化，且誘導具有劑量和時間效應。不同質(zhì)量濃度紅景天苷作用D1細胞24 h，與空白對照組比較，誘導組細胞CaM蛋白表達水平顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。與空白對照組比較5、10、20mg·L-1誘導組CaMKⅡ表達水平均上調(diào)，差異具具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，100mg·L-1誘導組CaMKⅡ表達水平顯著

10、下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。100 mg·L-1紅景天苷作用D1細胞12，24，48和72h，與空白對照組比較，CaM的表達有差異，且差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，12，24 h組表達上調(diào)，48，72 h組表達下調(diào)；CaMKⅡ蛋白表達與空白對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)，其中48 h組表達上調(diào)，異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其余各時間點表達均下調(diào)，異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.0

11、5，P<0.01)。
　?。?）阻斷劑組Western blot實驗結(jié)果：Ca2+阻斷劑作用后，與空白對照組比較，紅景天苷誘導組和各阻斷劑組CaM蛋白表達均顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與紅景天苷誘導組相比，CaM蛋白表達在LY294002加紅景天苷誘導組顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其余各阻斷劑組均顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。NSE蛋白表達與空白對照組相比，紅景天苷誘導組和各阻斷

12、劑組均顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05）；與紅景天苷誘導組相比，LY294002加紅景天苷誘導組、三種阻斷劑加紅景天苷誘導組、EGTA誘導組的NSE蛋白表達顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），EGTA加紅景天苷誘導組、LY294002誘導組、三種阻斷劑共同作用組表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05）。
　　（7）PCR-Array檢測結(jié)果：紅景天苷分別誘導D1細胞24、48和7

13、2h后，與空白對照組比較，表達有差異的基因共有38個，其中上調(diào)基因23個，下調(diào)基因15個，以5倍為差異顯著標準，經(jīng)過篩選上調(diào)較顯著的基因有：DNA損傷誘導轉(zhuǎn)錄因子3（ DNA damage-inducible transcript3，DDIT3）、熱休克蛋白5（Heat shock proteins，HSPA5）、磷酸酶1調(diào)節(jié)亞單位15a（Protein phosphatase1 regulatory subunit15a，Ppp1r1

14、5a）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶（Prostaglandin-endoperoxide synthase2，Ptgs-2）；下調(diào)較顯著基因有：胰高血糖素（Glucagon，Gcg），白細胞介素-2（Interleukin-2，Il-2），腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF），生長激素抑制素（Somatostatin，Sst）。
　?。?）Western blot結(jié)果顯示：與對照組比較，STAT3蛋白表達

15、在24、48h時降低，72h時升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。Ptgs-2的表達在72h時升高，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　?。?）紅景天苷能誘導D1細胞分化為神經(jīng)元細胞。
　?。?）在誘導D1細胞向神經(jīng)元細胞定向分化的過程中紅景天苷可能與L-型鈣通道阻斷劑作用類似，Ca2+／CaM信號通路在誘導分化過程可能起負調(diào)控作用。
　　（3）紅景天苷誘導D1細胞向神經(jīng)元細